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動(dòng)物淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的分離

時(shí)間:2014-2-20閱讀:307
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基本方案1:

 

灌注消化法

 

 

 

實(shí)驗(yàn)材料:

 

1.  哺乳動(dòng)物胸導(dǎo)管淋巴管

 

2.  1×PBS,含*100u/ml和*100μg/ml,pH7.4

 

3.  0.2%Ⅰ型膠原酶

 

4.  眼科剪,*

 

5.  慕絲線(7號(hào)線)、細(xì)鐵絲

 

6.  離心管(15ml、50ml)

 

 

 

實(shí)驗(yàn)方法:

 

1.  處死動(dòng)物后,打開(kāi)胸腔,分離胸導(dǎo)管,在胸導(dǎo)管上端結(jié)扎,切取10-15cm的一段。將胸導(dǎo)管放入預(yù)冷PBS中漂洗。

 

2.  在解剖顯微鏡下,用眼科剪和*剝除外膜的脂肪和纖維組織,然后用PBS反復(fù)沖洗管腔。

 

3.  將胸導(dǎo)管移入含PBS的大培養(yǎng)皿中,清洗3次。在胸導(dǎo)管的遠(yuǎn)端插入*,并結(jié)扎固定。用PBS沖洗管腔后,將游離端結(jié)扎。用*向管腔內(nèi)注入消化液,至淋巴管充盈為止。在37℃條件下,消化10min。淋巴管的管壁較薄,灌注消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),以免消化過(guò)度,引起成纖維細(xì)胞的污染。

 

4.  取出胸導(dǎo)管,在游離端剪一小口,用離心管收集消化液,然后用培養(yǎng)液沖洗管腔,收集消化液和沖洗液,以1000r/min,離心10min。離心后吸去上清液,用培養(yǎng)液輕輕混懸細(xì)胞。

 

5.  將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24h后補(bǔ)充培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2-3d換液1次。換液時(shí),吸去1/2-2/3培養(yǎng)液,再加入新鮮培養(yǎng)液。

 

6.  原代培養(yǎng)4-6h后,大部分細(xì)胞已貼壁生長(zhǎng)。24h后,內(nèi)皮細(xì)胞形成由數(shù)個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞群。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的活性較低,原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。2-3周后,細(xì)胞生長(zhǎng)形成單層。淋巴管內(nèi)皮單層呈卵石狀特征性排列,可傳代培養(yǎng)。

 

7.  PriCells-原代內(nèi)皮細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基

 

8.  PriCells-原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑

 

9.  PriCells-原代細(xì)胞分離試劑盒

 

10.  PriCells-原代細(xì)胞 鑒定 試劑盒

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