實(shí)驗(yàn)原理

體內(nèi)α-氨基酸 的α-氨基在氨基轉(zhuǎn)換酶的作用下，移換至α-酮酸的過(guò)程，稱(chēng)氨基轉(zhuǎn)換作用。此類(lèi)酶各有一定的特異性，普遍存在于動(dòng)物各組織中。

本實(shí)驗(yàn)是將*與丙酮酸在肌肉糜中*－丙酮酸氨基轉(zhuǎn)換酶（簡(jiǎn)稱(chēng)谷－丙轉(zhuǎn)氨酶 ）的作用下進(jìn)行氨基轉(zhuǎn)化反應(yīng)，然后用紙層析法檢查反應(yīng)體系中*的生成。其反應(yīng)過(guò)程如下：

由于*、丙酮酸在肌肉糜中可循其他代謝途徑分解和轉(zhuǎn)化，影響氨基轉(zhuǎn)換過(guò)程的觀(guān)察，因此在反應(yīng)體系中添加碘醋酸（或溴醋酸）以抑制*和丙酮酸的其他代謝過(guò)程。

試劑和器材

一、試劑

1%*溶液（用1% KOH溶液調(diào)到中性）；1%丙酮酸鈉溶液（用1% KOH溶液調(diào)到中性）；0.1%KHCO3溶液；0.025％溴醋酸溶液（用1% KOH溶液調(diào)到中性）；2% Hac溶液；0.1%標(biāo)準(zhǔn)*溶液；0.1%標(biāo)準(zhǔn)*溶液；1%KOH溶液。

展開(kāi)劑：酚飽和水溶液：2份酚加1份水混合放入分液漏斗 ，振蕩。靜置24小時(shí)后分層，取下層酚置瓶中備用；

顯色劑：0.1%茚三酮正丁醇溶液。

二、材料

肌肉糜：取兔子肌肉2g，置研缽 中，加0.9% 氯化鈉溶液6mL，在低溫下研磨成細(xì)漿，離心5分鐘（3000轉(zhuǎn)/分），棄去沉淀，得肌肉糜提取液。

三、器材

試管 1.5×15cm（′ 4）；研缽 （或玻璃勻漿器）；毛細(xì)管；燒杯 ；恒溫水浴 ；培養(yǎng)皿9cm（′ 2）；直徑13cm圓形濾紙 ；噴霧器；吹風(fēng)機(jī)。

操作方法

一、轉(zhuǎn)氨酶 作用

1、取試管 2只編號(hào)（1、2），向每個(gè)試管各加0.5mL 1%*溶液，0.5mL 1%丙酮酸鈉溶液，0.5mL 0.1%K HCO3和0.25mL 0.025%溴醋酸, 混勻。然后分別加入肌肉糜提取液0.5ml，混勻，將其中一制試管立即在沸水浴 中加熱2-3分鐘做對(duì)照。用塞子塞住另一只試管，置于45℃水浴中保溫 60min。

3、保溫完畢，取出試管。向每只試管中各加2% Hac溶液4滴，再置于沸水浴中2min，使蛋白質(zhì)*沉淀。過(guò)濾收集濾液待用。

三、層析驗(yàn)證

1、取培養(yǎng)皿一個(gè)，加入酚水飽和溶液、約0.5cm高，取圓形濾紙 一張，在中心剪一直徑1-2mm的小孔，并以圓心約1cm為半徑劃一圓作為底線(xiàn)。在此底線(xiàn)上，用鉛筆點(diǎn)四個(gè)等距離的原點(diǎn)并表明1，2，3，4；

2、用毛細(xì)管分別吸取以上兩種濾液及標(biāo)準(zhǔn)*、*，依次點(diǎn)在標(biāo)明號(hào)碼的原點(diǎn)處，以吹風(fēng)機(jī)吹干，再重新點(diǎn)樣 2-4次。注意斑點(diǎn)不能太大，一般直徑約0.3cm為宜。然后將濾紙平放在盛飽和酚的培養(yǎng)皿上。另取一條濾紙卷成筒狀，直徑約1-2mm,將此小筒插入濾紙中心小孔（不可突出紙面之上），使層析濾紙通過(guò)此小筒與酚溶液相連。另取一大小相同的培養(yǎng)皿蓋在濾紙上，此時(shí)酚溶液即由濾紙中心孔向四周擴(kuò)散。

3、當(dāng)酚溶液擴(kuò)展到距離紙邊緣約1.5cm時(shí)（約1小時(shí)），取出濾紙。用鉛筆化下酚溶液擴(kuò)展邊緣，用吹風(fēng)機(jī)吹干。用噴霧器噴以0.1%茚三酮溶液，再用熱風(fēng)吹干。用鉛筆圈下各顯色點(diǎn)。測(cè)定各顯色點(diǎn)的Rf值，并解釋之。

四、計(jì)算公式：

Rf＝原點(diǎn)至斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)至溶劑前沿的距離