間隙連接蛋白45抗體說明書，CX45抗體價格

注意：當在組織培養(yǎng)板中進行不同劑量的siRNA轉(zhuǎn)染時，轉(zhuǎn)染試劑和siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的用量需要與不同孔的表面積成比率。

1，準備以下混合物：

（A）加1.8ul的10um siRNA到20ul 的siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，輕柔混合，在室溫放置5分鐘  注意：如果需要低濃度的siRNA，用siRNA稀釋緩沖液稀釋

（B） 加1.2ul siRNA轉(zhuǎn)染試劑到20ul siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，輕柔混合，室溫放置5分鐘。注意：雖然，對多種的細胞系有很高的轉(zhuǎn)染效率，但siRAN轉(zhuǎn)染試劑并不是對所有細胞都適合。

2，5分鐘后，混合A和B，形成siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物，輕柔混合，室溫孵育20分鐘。

3，孵育后，加160ul siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基到每個含有siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物的管中，輕柔混合

  從這一步起，對懸浮細胞和貼壁細胞的處理方法相同

4，轉(zhuǎn)染前，吸棄培養(yǎng)基，用0.3ml無菌siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基洗細胞一次，去除培養(yǎng)基。

5，在洗過的細胞上，鋪稀釋的siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合物，37度，5-7小時

6，孵育后，向含有轉(zhuǎn)染細胞的每個孔中加200ul 生長培養(yǎng)基，其中的血清和抗生素濃度是正常濃度的兩倍，無需去除轉(zhuǎn)染混合物。如果，毒性是個問題的話，去除轉(zhuǎn)染混合物，以正常生長培養(yǎng)基代替。再孵育18-24小時

7,孵育結(jié)束后，用新鮮正常生長培養(yǎng)基替換，繼續(xù)孵育24-72小時

8,使用恰當?shù)牟僮鞑襟E檢測細胞，參見免疫熒光染色步驟

染色質(zhì)免疫沉淀間隙連接蛋白45抗體說明書，CX45抗體價格

注意：CHIP的實驗步驟可以有很多不同版本，下面介紹的步驟適合大多數(shù)的實驗

常溫下，用PBS洗細胞，重懸細胞，使細胞數(shù)大約5*10⁵個/ml（總細胞數(shù)2*10⁷）。,

加甲醛，使終濃度為1%，室溫孵育10分鐘。

加*至終濃度0.125M，終止交聯(lián)反應(yīng)

2000rpm,5分鐘，離心細胞。用冷的PBS洗細胞一次

用6ml的裂解緩沖液重懸細胞，輕柔混合，2000rpm離心5分鐘，收集粗提的核提取物。

再用PBS洗沉淀，沉淀可以凍存，或繼續(xù)以下步驟。

用1.9ml的高鹽裂解緩沖液重懸沉淀，轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中準備超聲

超聲條件需要優(yōu)化，下面介紹的條件是在使用Sonics VC130和3mm的探頭的基礎(chǔ)上建立起來的：

在冰上操作，輸出功率設(shè)置5（R）6,每隔30秒超聲一次，共4次。

4°C，10，000rpm 離心15分鐘，保存上清，確定上清中蛋白的濃度。

如果免疫沉淀，我們推薦100—500ug蛋白和0.1—1ul的TransCruz試劑（0.2—2ug）

注意：研究者可能希望使用連接有葡聚糖或磁珠的一抗，以便于選擇后續(xù)免疫沉淀的試劑。有些情況下，將針對同一種蛋白不同表位的抗體聯(lián)合使用會更好。

向染色質(zhì)溶液加50ul Protein A/G-瓊脂糖，4度，孵育30分鐘，使其澄清，zui大速度，4度離心5分鐘。

向上清中加一抗，4度孵育過夜。

加50ul Protein A/G –瓊脂糖，4度孵育2小時。

12，000rpm離心20秒收獲磁珠，并將管放在冰上

用1ml裂解緩沖液洗磁珠2次

用沖洗緩沖液洗磁珠四次

重懸磁珠在400ul洗脫緩沖液中

通過在67度水浴中孵育管子2小時以上，使反向交叉連接

離心去除磁珠，繼續(xù)在67度水浴孵育上清過夜 Remove

10,000rpm離心3分鐘去除殘留的珠子，保留上清

分離DNA,用500ul 酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）抽提上清,劇烈振蕩，14,000rpm離心3分鐘分離兩相。

保留水相，用100ul10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 （TE）  反向抽提有機相一次，在匯集水相

用600ul 氯仿/異戊醇抽提匯集的水相

DNA可以用商業(yè)化的試劑盒濃縮。