單分子測(cè)序解析超級(jí)細(xì)菌

上海雙博生物科技有限公司的研究人員利用PacBio的單分子實(shí)時(shí)（SMRT）測(cè)序技術(shù)，解析了與腸桿菌（Enterobacteriaceae）相關(guān)的醫(yī)院獲得性感染中質(zhì)粒介導(dǎo)的抗生素耐藥性。

研究人員從2011年爆發(fā)“超級(jí)細(xì)菌”的NIH醫(yī)院中采集了革蘭氏陰性的腸桿菌分離株，并分析了其中含有抗生素耐藥性酶的質(zhì)粒。他們的研究結(jié)果顯示攜帶這些耐藥基因的背景質(zhì)粒的廣泛多樣性，且許多耐藥性相關(guān)的質(zhì)粒來(lái)自醫(yī)院環(huán)境內(nèi)或外的獨(dú)立來(lái)源。

為了鑒定腸桿菌攜帶的編碼碳青霉烯酶的質(zhì)粒，以及它們?cè)诩?xì)菌物種之間的移動(dòng)，研究人員對(duì)臨床和醫(yī)院環(huán)境的腸桿菌分離株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，如肺炎克雷伯菌，產(chǎn)酸克雷伯菌和大腸桿菌，它們都含有一個(gè)或多個(gè)碳青霉烯耐藥的質(zhì)粒。

研究小組主要關(guān)注與碳青霉烯酶相關(guān)的耐藥性，這涉及到所謂的KPC基因。研究人員解釋道，2011年NIH臨床中心有18名患者感染腸桿菌，其中就攜帶了包含KPC的質(zhì)粒。

腸桿菌的碳青霉烯耐藥性也來(lái)源于另一種質(zhì)粒，它包含由NDM1基因編碼的碳青霉烯酶。

在此次分析中，研究人員從NIH臨床中心的近1100名患者身上采集了樣本。這包括直腸、咽喉和/或腹股溝拭子，在2012-2013年期間從醫(yī)院的重癥監(jiān)護(hù)室和高危內(nèi)科病房的患者中采集（每周兩次），以及從其他病房中采集的監(jiān)控樣本（每月一次），和新入院患者的樣本。

當(dāng)他們篩查超過(guò)14,200個(gè)患者樣本及數(shù)百個(gè)從醫(yī)院環(huán)境中采集的樣本時(shí)，研究小組追蹤到10名患者，攜帶了包含KPC陽(yáng)性質(zhì)粒的腸桿菌。還有兩名患者在出院后被檢測(cè)出KPC腸桿菌呈陽(yáng)性。

研究人員之前試圖利用短讀取（short-read）測(cè)序技術(shù)對(duì)含有KPC的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序和追蹤，但遇到了一些問(wèn)題。Segre解釋道，部分原因在于含有抗性基因的質(zhì)粒往往含有大的、移動(dòng)的遺傳元件。

她指出，以這項(xiàng)研究中的碳青霉烯耐藥性質(zhì)粒為例，KPC基因的兩側(cè)伴有Tn4401轉(zhuǎn)座子，伸出去多達(dá)10,000個(gè)堿基。因此，在試圖鑒定每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中的多個(gè)質(zhì)粒時(shí)就面臨挑戰(zhàn)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究人員決定利用PacBio的RSII系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生單分子的長(zhǎng)讀取，這讓他們能夠同時(shí)查看細(xì)菌基因組的序列和質(zhì)粒的序列。

利用這種方法，他們對(duì)2012-2013年鑒定出的12名KPC陽(yáng)性患者的分離株進(jìn)行了測(cè)序，同時(shí)對(duì)2011年爆發(fā)期間采集的2個(gè)分離株和醫(yī)院內(nèi)的6個(gè)環(huán)境監(jiān)控樣本進(jìn)行了測(cè)序。

總的來(lái)說(shuō)，這些序列代表了克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和泛菌屬（Pantoea）的物種，以及大小在9,300和379,000個(gè)堿基的質(zhì)粒，這讓研究團(tuán)隊(duì)能夠鑒定潛在的傳播事件。

研究人員發(fā)現(xiàn)，根據(jù)共同的遺傳特征，2012-2013年僅有1個(gè)病例可與2011年的爆發(fā)直接關(guān)聯(lián)。相反，研究結(jié)果表明，許多碳青霉烯耐藥性質(zhì)粒是在各中心獨(dú)立引入的，與早期感染沒(méi)有明確的流行病學(xué)。讓人意外的是，序列數(shù)據(jù)還說(shuō)明耐藥質(zhì)粒很少發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。

研究人員也在嘗試模擬醫(yī)院生物膜的情況，以便弄清楚哪些情況可能會(huì)促使含KPC的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的微生物宿主。

研究人員還在繼續(xù)對(duì)新入院的患者以及重癥監(jiān)護(hù)室和其他病房中的患者進(jìn)行積極監(jiān)控。

對(duì)于目前的研究，每個(gè)樣本的測(cè)序價(jià)格大約是1200美元，但Segre指出，一旦所有質(zhì)粒的完整參考基因組都產(chǎn)生，還是能夠在高通量的短讀取儀器上開(kāi)展更經(jīng)濟(jì)的測(cè)序。