檢測(cè)原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 。往 預(yù)先包被植物果糖磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒 抗體的包被微孔中,依 次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,經(jīng)過(guò)溫育并洗滌。 用底物TMB顯色,TMB在化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的 作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度  (OD 值) ,計(jì)算樣品活性。

樣品收集、處理及保存方法

1.  樣本不能含疊氮鈉 (NaN3) ,因?yàn)榀B氮鈉 (NaN3) 是辣根 化物酶 (HRP) 的劑。

2.  標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行。

3.  植物萃取液或其它相關(guān)樣本:請(qǐng)1000 x g離心20分鐘,取上清 即可檢測(cè)。

4.  保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè),請(qǐng)按一次用量分裝,凍存

于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1. 酶標(biāo)儀 (450nm)

2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

操作注意事項(xiàng)

1.  試劑盒保存在 2-8℃ ,使用前室溫平衡 20 分鐘。從冰箱取出的 濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶,這屬于正常現(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶溶解 后再使用。

2.  實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,密封 (低溫干燥) 保 存。

3.  濃度為 0 的 S0 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對(duì)照或者空白;按照說(shuō)明 書操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋 5 倍,最終結(jié)果乘以 5 才是樣本實(shí)際濃度。

4.  嚴(yán)格按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.  所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

注:標(biāo)準(zhǔn)品 (S0-S5) 濃度依次為:0,20,40,80,160,320 U/mL

試劑的準(zhǔn)備

20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按 1:20 稀釋,即 1 份的20×洗滌 緩沖液加 19 份的蒸餾水。

洗板方法

1.  手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,靜置 1min 后甩盡 孔內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,如此洗板 5 次。

2.  自動(dòng)洗板機(jī):每孔注入洗液 350 μL,浸泡 1min,洗板 5 次。

1.  從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自 封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50 μ L;

3.  樣本孔先加待測(cè)樣本 10 μL,再加 40 μL;空白孔不 加。

4.  除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根化物酶  (HRP) 標(biāo)記的檢測(cè)抗體 100 μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋 或恒溫箱溫育 60min。

5.  棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置 1min,甩去 洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板 5 次 (也可用洗板機(jī)洗板) 。

6.  每孔加入底物 A、B 各 50 μL,37℃避光孵育 15min。

7.  每孔加入終止液 50 μL,15min 內(nèi),在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的 OD 值。

結(jié)果判斷

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:在 Excel 工作表中,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng) OD 值作縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,按曲線方程計(jì)算各樣 本濃度值。