熒光標(biāo)記

　　熒光修飾可以通過(guò)共價(jià)鍵的形式連接在多肽序列的N端或C端，但是更推薦在N端進(jìn)行修飾。以下為合生生物常用熒光修飾以及發(fā)光顏色。

    

　　多肽熒光標(biāo)記結(jié)合成像技術(shù)后可用于識(shí)別特定靶點(diǎn)。共聚焦或熒光顯微鏡的體外成像仍然是研究細(xì)胞內(nèi)各種生物過(guò)程和相互作用十分有效的方法之一。與蛋白質(zhì)不同，這些肽定位于肌動(dòng)蛋白上的特定靶點(diǎn)，不易聚集蛋白質(zhì)，因此非常適合于體外跟蹤。同樣，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CPP也可被用于細(xì)胞內(nèi)組分的成像，且其細(xì)胞毒性低。

　　其中，F(xiàn)ITC是一種胺活性的熒光染料，可廣泛的用于標(biāo)記多肽和蛋白質(zhì)。合生生物在N端標(biāo)記Fitc，都會(huì)建議在后面一個(gè)氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應(yīng)產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入烷基間隔器（alkyl spacer）如AJYS（Ahx）。鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標(biāo)記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來(lái)形成熒光素，通常會(huì)伴有后面一個(gè)氨基酸的去除，但當(dāng)有一個(gè)間隔器如AJYS，或者是通過(guò)非酸性環(huán)境將目的肽從樹(shù)脂上切下來(lái)時(shí)，這種情況可避免?？臻g位阻被認(rèn)為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。

　　下圖是合生生物多肽熒光標(biāo)記經(jīng)典案例之一：

　　合成FITC-Ahx-RAKWNNTLKQIASK的MS&HPLC圖譜

　　對(duì)于較長(zhǎng)的序列，建議使用FRET pairs(fluorescence resonance energy transfer pairs)進(jìn)行修飾。

　　熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是描述兩個(gè)熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移的機(jī)制。由于FRET效率部分基于供體和受體分子之間的距離，因此該技術(shù)通常用于研究酶效率，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或其他分子動(dòng)力學(xué)。

　　圖1.蛋白酶研究的FRET機(jī)制。

　　(當(dāng)肽保持完整時(shí)，受體分子將淬滅供體分子，并且不會(huì)檢測(cè)到熒光。如果序列被蛋白酶活性切割，則受體將不再淬滅供體，并且將檢測(cè)到熒光信號(hào))

　　FRET肽是研究肽酶特異性的便利工具，由于其反應(yīng)過(guò)程可被連續(xù)監(jiān)測(cè)，為酶活性的檢測(cè)提供了一個(gè)便捷的方法。

　　供體/受體對(duì)的肽鍵水解后產(chǎn)生的熒光可衡量納摩爾級(jí)濃度的酶活性。當(dāng)FRET肽是完整的，表現(xiàn)出的是內(nèi)部的熒光猝滅，但當(dāng)供體/受體對(duì)的任何肽鍵斷裂就會(huì)釋放出熒光，此熒光可被連續(xù)檢測(cè)，從而可對(duì)酶的活性進(jìn)行定量分析。

　　FRET肽可作為各類酶研究的合適底物，比如：

　　1.肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的動(dòng)力特征和功能特征。

　　2.對(duì)新的蛋白水解酶的篩選和檢測(cè)。

　　3.對(duì)多肽折疊的構(gòu)象研究。