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ELISA實驗中的酶和底物的成分及優(yōu)點

時間:2024-3-5閱讀:121
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ELISA實驗中對所使用的酶也有所要求,主要為純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價格便宜、制備成的酶標抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定,與抗體或抗原偶聯(lián)后需繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標本中不存在與標記酶相同的酶。此外,酶的底物應(yīng)易于制備和保存,價格低廉,有色產(chǎn)物易于測定,光吸收度高。ELISA中常用的酶為辣根過氧化酶(HRP)和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶(AP)。

 

HRP在蔬菜作物辣根中含量很高,純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白,含糖量約18%,分子量為 44kD,是一種復(fù)合酶,由主酶(酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅素)結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白,在275nm 波長處有最高吸收峰;輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán),在403nm 波長處有最高吸收峰。

 

HRP的純度用RZ(ReinheitZahl,意為純度數(shù))表示,是403nm的吸光度與280nm的吸光度之比,高純度的 HRP的 RZ≥3.0。應(yīng)注意的是酶變性后,RZ 可不變但活力降低,故選用酶制劑時更重要的指標為活力。酶活力以單位表示:1 min 將1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為1個單位。HRP催化反應(yīng):DH2 + H2O2—— D +2H2O。

 

OPD是在ELISA中應(yīng)用最多的底物,靈敏度高,比色方便。其缺點是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差,而且有潛在的致癌作用,使用時應(yīng)注意防護。而TMB無此缺點,TMB經(jīng)酶作用后由無色變藍色,目測對比鮮明;加酸停止酶反應(yīng)后變黃色,可在比色計中定量;因此應(yīng)用日見增多。

 

ABTS雖然靈敏度不如OPD和TMB,但空白值很低。在ELISA中另一常用的酶為堿性磷酸酶。從大腸桿菌提取的AP分子量為 80kD,酶作用的最適pH為8.0;用小牛腸粘膜提取的AP分子量為100kD,最適pH為9.6。一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作為底物。它可制成片狀試劑,使用方便。

 

產(chǎn)物為黃色的對硝基酚,在405nm 有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后,黃色可穩(wěn)定一段時間。在ELISA中應(yīng)AP系統(tǒng),其敏感性一般高 HRP系統(tǒng),空白值也較低。但由于獲得高純度AP較難,穩(wěn)定性較HRP低,價格較HRP高,且制備酶結(jié)合物時得率較HRP低等原因,在ELISA中一般較多采用HRP。

 

HRP和AP以外,可應(yīng)用于ELISA試劑中的酶還有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。如β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-D半乳糖苷(4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside),經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘酮(4-mehtylumbelliferone),可用熒光計檢測。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可使用可產(chǎn)生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點是需要熒光計測定,而且如用固相載體直接作為測定容器,此載體不可發(fā)出熒光。

 


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