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上海斯邁歐分析儀器有限公司
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液相色譜儀和蒸發(fā)光散射檢測器分析中藥柴胡
2023-3-19 閱讀(73)
摘要本文闡述了用于柴胡分析的傳統(tǒng) HPLC 和高分離度快速液相色譜（RRLC）方法的開發(fā)。對不同柴胡樣品指紋圖譜的比較顯示了不同產(chǎn)地采集的中藥具有不同的色譜峰形。優(yōu)化了 Agilent 1200 系列蒸發(fā)光散射檢測器的方法參數(shù)，可得到最大的響應(yīng)值。開發(fā)了測定不同中藥及其制劑中六種柴胡皂苷含量的定量方法。
前言柴胡為傘形科植物北柴胡（BupleurumChinese DC） 或 狹 葉 柴胡（ B.scorzonerifolium）的干燥根，是最為常用的中藥材之一。參照《中國藥典》1，B.Chinese DC 和 B. scorzonerifolium （傘形科）分別習(xí)稱為“北柴胡"和“南柴胡"。除了北柴胡與南柴胡，中國還有其他藥材品種以柴胡入藥。許多的中成藥復(fù)方制劑中用到柴胡，它可以用于治療感冒發(fā)熱。柴胡中含有多種成分，其中柴胡皂苷被認(rèn)為與治療作用關(guān)系最大。曾有報道使用HPLC 以紫外檢測器在 210 nm 以下的低波長處對多種柴胡中的柴胡皂苷進(jìn)行測定。使用甲醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行梯度洗脫時，以如此低的檢測波長不可能得到平穩(wěn)的基線?；€的漂移可能對定量分析產(chǎn)生影響，因?yàn)樯V峰可能無法得到正確的積分。柴胡中的一些柴胡皂苷是多萜類皂苷，僅在低波長處具有紫外吸收。另一些柴胡皂苷具有二烯結(jié)構(gòu)，因此較易進(jìn)行紫外檢測。在柴胡的切片或 HPLC 樣品制備過程中當(dāng)處于高溫和低 pH 條件時，多萜類皂苷不穩(wěn)定，易轉(zhuǎn)化為二烯結(jié)構(gòu)。
LC/MS 也已用于柴胡的研究，其檢測限更低，靈敏度更高，但是儀器設(shè)備較為昂貴，而且要求操作人員具備質(zhì)譜知識。目前，趨向于使用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）分析柴胡，在中國的科學(xué)期刊上已有多篇論文發(fā)表 2,3。ELSD 可用于檢測所有比溶劑揮發(fā)性小的被分析物，能夠保持平穩(wěn)的基線，而與溶劑的紫外吸收或梯度條件無關(guān)。柴胡皂苷含有 1 個或 2 個雙鍵，在 ELSD 上的信號沒有差別。一些在低波長處有紫外吸收的揮發(fā)性組分，使用ELSD 時沒有響應(yīng)，因此在對柴胡皂苷進(jìn)行定量分析時不會對積分產(chǎn)生干擾。柴胡的指紋圖譜對于鑒定其產(chǎn)地非常重要。柴胡中除了柴胡皂苷以外的其他成分也對治療作用具有不同的貢獻(xiàn)。為獲得柴胡的全面信息，應(yīng)同時使用 UV 檢測器和ELSD 以檢測柴胡皂苷和其他成分的色譜峰。
根據(jù)參考文獻(xiàn)，傳統(tǒng) HPLC 方法分離幾種柴胡皂苷需要 50 分鐘。為加速分析進(jìn)程，RRLC 越來越引起人們的關(guān)注。RRLC 在保持分析性能的同時，可以縮短運(yùn)行時間并降低成本。本文中同時應(yīng)用了兩種方法，對不同的液相色譜系統(tǒng)配置給出參考。對不同樣品得到的不同譜圖進(jìn)行了討論，同時，定量分析結(jié)果顯示不同樣品中柴胡皂苷的含量也有差異。
實(shí)驗(yàn)部分標(biāo)樣和試驗(yàn)材料6''-乙?；?SSa (3)、3''-乙?；?SSd (5) 和6''-乙?；?SSd (6) 是在實(shí)驗(yàn)室中從中藥柴胡的根部分離得到。SSa (2) 和 SSd (4) 購自中國藥品生物制品檢定所（中國北京）。SSc (1) 購自中藥固體制劑國家研究中心（中國江西）。通過光譜數(shù)據(jù)（UV、MS、1HNMR 和 13C NMR）與文獻(xiàn)值的比較，對這些化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。研究用原料藥材由研究組成員收集而得。
儀器一臺 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)同時用于傳統(tǒng) HPLC 和 RRLC 方法的開發(fā)。該系統(tǒng)包含以下模塊：• Agilent 1200 系列 SL 型雙泵，帶真空脫氣機(jī)• Agilent 1200 系列 SL 型高效自動進(jìn)樣器• Agilent 1200 系列 SL 型柱溫箱• Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢測器，具備微量流通池（容量 2 µL，光程3 mm）• Agilent 1200 系列蒸發(fā)光散射檢測器，帶標(biāo)準(zhǔn)噴霧器• Agilent ChemStation，軟件版本 B.03.02，用于儀器控制、數(shù)據(jù)采集和評價
圖 2 顯示了使用 RRLC 方法的分析結(jié)果，運(yùn)行時間由 60 分鐘縮短為 6 分鐘。色譜圖基線平穩(wěn)，而且色譜峰分離良好。洗脫順序與傳統(tǒng) HPLC 方法一致，因?yàn)閮煞N色譜柱使用了同一種鍵合類型的填料
參照《中國藥典》，錐葉柴胡（25 號樣品）并非典型的柴胡。然而，實(shí)際上一些老中醫(yī)仍然使用這種柴胡。圖 3 為 ELSD 和UV 檢測所得色譜圖。與典型柴胡相比，25 號樣品的 HPLC 譜圖中有更多的色譜峰。通過比較 ELSD 和 UV 信號，兩類色譜峰能夠得到識別。這證明 ELSD 和 UV檢測器因?yàn)槟軌驒z測不同種類的化合物而具有互補(bǔ)作用。第一類色譜峰中化合物的揮發(fā)性比溶劑強(qiáng)，并且含有發(fā)色團(tuán)。第二類色譜峰中化合物的揮發(fā)性較溶劑弱，且不含發(fā)色團(tuán)。這些色譜峰的化合物結(jié)構(gòu)仍然未知。將這些結(jié)果與藥理學(xué)研究相結(jié)合，能夠揭示是否這些色譜峰中的化合物具有治療作用。
