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上海斯邁歐分析儀器有限公司
主營(yíng)產(chǎn)品： 氣相色譜、液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用儀、液質(zhì)聯(lián)用儀、原子吸收光譜儀、紫外分光光度計(jì) |
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血漿藥物定量分析所需的高速、超高靈敏度和耐用性
2023-2-28 閱讀(50)
摘要本文介紹了安捷倫 1200 系列高分離度快速液相色譜儀（RRLC）配合安捷倫 6460A 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀在人血漿生物分析中的應(yīng)用。高通量分析表現(xiàn)在：待測(cè)藥物和內(nèi)標(biāo)物都能夠在色譜中于 1 分鐘內(nèi)洗脫。超高靈敏度表現(xiàn)在：線性范圍涵蓋了人體血漿微劑量水平藥代動(dòng)力學(xué)研究的典型濃度范圍（1–500 pg/mL 血漿濃度）。耐用性和重現(xiàn)性表現(xiàn)在：在上述濃度范圍，5 天之內(nèi)通過(guò)該LC/MS 系統(tǒng)可分析超過(guò)1000 個(gè)血漿樣品。
引言使用 LC/MS 定量分析生理樣本如血漿和血清中的藥物，可以認(rèn)為是藥物發(fā)現(xiàn)中藥代動(dòng)力學(xué)（PK）研究的特征。通過(guò) LC/MS分析得到的 PK 圖線提供了候選藥物的生物利用率和半衰期信息，以便比較并選出先導(dǎo)化合物用于進(jìn)一步研究。制藥行業(yè)需要靈敏度高、選擇性好、耐用性強(qiáng)的分析方法，同時(shí)還應(yīng)具有高通量，以便快速獲得這些信息并迅速作出判斷。由于由體外實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的 PK 數(shù)據(jù)外推得到的人體劑量數(shù)據(jù)常常具有誤導(dǎo)性，出現(xiàn)了“first-in-human trial"（人體試驗(yàn)，即人體微劑量試驗(yàn)）的概念，因而對(duì)生物分析的靈敏度設(shè)置了更嚴(yán)格的要求，即人體微劑量水平實(shí)驗(yàn)的藥物用量必須要低于動(dòng)物或體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蓄A(yù)期治療劑量的1/1001–8。目的為證實(shí)安捷倫 1200 系列高分離度快速液相色譜（RRLC）與安捷倫 6460A 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的高通量、超高靈敏度和耐用性而設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。人血漿中添加藥物的濃度設(shè)定在人體微劑量水平研究的典型范圍（1–500 pg/mL 血漿濃度）。在隨后的血漿檢測(cè)中，五個(gè)工作日內(nèi)完成了包含 1000 多個(gè)樣品的分析序列（例如每天進(jìn)樣 200 次）。每天的分析序列之后都用血漿中藥物的系列標(biāo)樣來(lái)評(píng)估系統(tǒng)性能。
實(shí)驗(yàn)儀器• 安捷倫 1200 系列 RRLC 系統(tǒng)，包括 SL二元泵、微量真空脫氣機(jī) 、SL 柱溫箱和SL 自動(dòng)進(jìn)樣器。• 安捷倫 6460A 質(zhì)譜儀• 安捷倫 20 通多用途真空處理站• 安捷倫 SampliQ 優(yōu)化聚合物技術(shù)（OPT）萃取柱（30 mg）• 安捷倫 ZORBAX C18 Eclipse Plus 色譜柱 2.1 mm × 50 mm，1.8 µm• 安捷倫 Mass Hunter 工作站軟件，用于儀器控制、數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)處理LC 方法操作條件流動(dòng)相 A 水 [0.1% 甲酸（FA）]流動(dòng)相 B 乙腈（ACN）（0.1 % FA）梯度設(shè)置 t (min) %B0 300.1 300.95 601 601.01 901.20 901.21 30流速 0.8 mL/min柱溫 40 °C停止時(shí)間 1.5 min梯度平衡時(shí)間 2.5 min進(jìn)樣體積 8 µL洗針 10 s，乙腈/水 60:40 v/v(0.1% TFA)
MS 方法操作條件掃描模式 采用 MRM MasshunterOptimizer 軟件獲得如表 1 中所示的優(yōu)化條件。離子化模式 結(jié)合安捷倫噴射流技術(shù)的ESI 正離子模式干燥氣溫度 300 °C干燥氣流速 11 L/min霧化器壓力 20 psi毛細(xì)管電壓 2000 V鞘氣溫度 400 °C鞘氣流速 12 L/min噴嘴電壓 0 V化學(xué)品人體血漿以及所有標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品（去甲替林、曲米帕明、甲酸（FA）購(gòu)于 Sigma-Aldrich 公司（德國(guó)）。HPLC級(jí)水購(gòu)自 Burdick & Jackson 公司（美國(guó)），HPLC 級(jí)乙腈和甲醇購(gòu)自 Merck 公司（德國(guó)）。血漿檢測(cè)校正標(biāo)樣：10 µL 去甲替林的參比標(biāo)樣（溶于乙腈/水 = 70:30，v/v）添加到 190 µL 人血漿中，用來(lái)配制空白溶液和在1 - 500 pg/mL 范圍內(nèi)的 6 個(gè)濃度的標(biāo)樣溶液，添加 400 µL 2% 甲酸和 20 µL 曲米帕明內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻。安捷倫 SampliQ OPT 固相萃取柱（30 mg）用 1 mL 甲醇和 1 mL 水（0.1% 甲酸）活化，加入樣品混合物后先后用 1 mL 0.1%磷酸和 1 mL 5% 乙腈溶液淋洗，然后用200 µL 乙腈/水 = 70:30（ v/v）洗脫，提取物用水稀釋 2 倍，使溶劑組成與流動(dòng)相初始比例相似。血漿樣本按相同步驟進(jìn)行處理，4000 rpm 離心 5 分鐘后進(jìn)樣
結(jié)果與討論基質(zhì)效應(yīng)和回收率通過(guò)新型 SampliQ OPT 填料獲得的基質(zhì)效應(yīng)因子和回收率分別參考 Zweigenbaum等提出的公式（1）和（2）9,10。去甲替林標(biāo)樣配制兩個(gè)濃度：500 和 100 pg/mL，添加后的血漿和空白樣本，按前述血漿檢測(cè)方法進(jìn)行提取?？瞻滋崛∫航?jīng)緩速氮?dú)獯蹈珊笥脜⒈葮?biāo)樣重新溶解。通過(guò)這種方法，就可在已提取添加溶液、提取后空白添加溶液和參考標(biāo)樣中獲得相同的去甲替林濃度。將樣品以1 µL 體積重復(fù)進(jìn)樣兩次，取平均值進(jìn)行計(jì)算。去甲替林濃度為 500和 100 pg/mL 時(shí)回收率分別為 97% 和95%?；|(zhì)效應(yīng)因子為 0.8。內(nèi)標(biāo)物曲米帕明的結(jié)果與之相近。高通量 LC/MS 方法圖 1 是 SPE 提取物的典型 MRM 譜圖。在提取前血漿中去甲替林的濃度為 500 pg/mL。去甲替林和內(nèi)標(biāo)物在 1 分鐘內(nèi)可以洗脫下來(lái)，證明該 LC/MS 分析的高通量特性，使用色譜柱交替再生技術(shù)還可以獲得更高的通量。使用 RRLC系統(tǒng)，在進(jìn)行此類(lèi) PK 分析時(shí)，分析周期時(shí)間（包括進(jìn)樣、樣本分析、柱再生）可以低于1.5 分鐘11。
