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上海斯邁歐分析儀器有限公司
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高效液相色譜分析進行完整甘油三酯的高分離度反
2023-2-21 閱讀(76)
摘要 ：用配置紫外/可見光（UV/VIS）二極管陣列檢測器（DAD）的 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)在無水反相梯度條件下，分析大豆油中的甘油三酯。使用 Agilent 1290 Infinity液相色譜系統(tǒng)在不同長度、1.8 µm 充填粒度、600bar（9000psi）或 1200bar（18,000 psi）壓力下、內(nèi)徑為 3.0 mm 和 2.1 mm 的 C18 色譜柱上進行樣品的色譜分離。本報告演示了異丙醇（IPA）或甲基叔丁基醚（MTBE）作為強溶劑和乙腈作為弱組分的混合流動相條件下，Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)能夠采用高分離度長色譜柱。
前言對來自動物或植物的完整甘油三酯進行分析具有很強的實用價值，包括加深對甘油三酯化學(xué)組成的理解、評估燃料潛熱、了解生物系統(tǒng)的脂代謝行為。高效液相色譜（HPLC）成功分析這些組分的基本條件包括：梯度洗脫及整體分離過程的低波長監(jiān)測。甘油三酯發(fā)色團相對較少，這有利于使用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）或質(zhì)譜儀，以便于實現(xiàn)分離的其他目的。在此應(yīng)用的開發(fā)過程中，我們對來自大豆、玉米、米糠、紅花、葡萄籽、橄欖及棕櫚油的植物油進行了分析。由于大豆油在美國廣泛使用，且對生物燃料生產(chǎn)的意義不斷增長，本應(yīng)用的主要工作是最大限度地使大豆油甘油三酯的分離度符合標(biāo)準(zhǔn)要求。這些基本條件也適用于各種包括源自動物脂肪的樣品。完整甘油三酯通常水溶性非常低，因此常采用常規(guī)色譜法進行分離，該方法主要依靠極性功能團的差異分離樣品，或非水分離模式的反相色譜法，它對于如鏈長或鏈不飽和度等碳性的微小差異有更好的選擇性。據(jù)珀金斯公布的資料[1]，在大豆油中發(fā)現(xiàn)的主要脂肪酸（甘油三酯的甘油骨干組成部分）是肉豆蔻（14:0）、棕櫚（16:0）、油酸（18:1 ）、麻酸（18:3），也存在許多其他小脂肪酸。因為脂肪酸都是隨機構(gòu)造為甘油三脂，所以脂肪酸亞結(jié)構(gòu)的廣泛轉(zhuǎn)換是可能存在的。由于脂肪酸之間的主要差別是碳鏈長度和雙鍵數(shù)，所以甘油三酯的多樣性主要呈現(xiàn)非極性有機結(jié)構(gòu)的特征。因此，反相色譜適于此類應(yīng)用。由于甘油三酯的水溶性極差，您可以選擇一個與水含量相關(guān)的較高的有機起始點，或如本報告，選擇一個無水的分離環(huán)境。甘油三酯的典型結(jié)構(gòu)如圖 1 所示[2]。在這個圖中，從上到下，分別為棕櫚酸（C16:0）、油酸（C18:1）、a-亞麻酸（C18:3），顯示了其鏈長和不飽和度?；瘜W(xué)式為C55H98O6。
實驗樣品制備初始溶液的濃度為 10 mg/mL，異丙醇或甲醇/甲基叔丁基醚體積比為 2:1，隨后根據(jù)需要稀釋到更低濃度。LC/DAD 系統(tǒng)的進樣量為 0.2-2 µL。LC 方法詳細說明液相色譜條件Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)二元泵 G4220A,Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)自動進樣器 G4226A配切換閥的安捷倫柱溫箱 G1316C配有 10mm 通徑光纖流通池的 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)二極管陣列紫外/可見檢測器 G4212A色譜柱: （具體使用見各自的色譜圖）Agilent ZORBAX SB-C18 RRHT，3 mm × 150 mm, 1.8 µm600 bar，部件號 829975-302Agilent ZORBAX SB-C18 RRHD, 2.1 mm × 100 mm, 1.8 µm1200 bar, 部件號 858700-902Agilent ZORBAX SB-C18 RRHD, 2.1 mm × 150 mm, 1.8 µm1200 bar, 部件號 859700-902某些情況下，色譜柱要串聯(lián)以增加長度和分離度柱溫: 20 °C 或 30 °C流動相： A=乙腈B=異丙醇(IPA)或甲基叔丁基醚(MTBE)（具體流動相見各自的色譜圖）流速： 具體流速見各自的色譜圖梯度： 基于與 IPA 相比，MTBE 的洗脫強度高，梯度條件為 20% 至60% 的異丙醇或 10% 至 40% 的 MTBE。對于異丙醇梯度，梯度斜率一直維持在每柱容增加 2.6% 的有機相，MTBE 為 2.0%，相應(yīng)地改變梯度時間和流速。這是使用安捷倫方法轉(zhuǎn)化器計算而確定的[3]。
UV 條件：監(jiān)測 210 nm、220 nm 和 230nm，帶寬 4nm，參考波長關(guān)閉
結(jié)果和討論以乙腈 IPA 梯度對甘油三酯的典型梯度分離如圖 2 所示。一些通用的解釋適用于圖 2 中所示的條件和色譜圖。雖然理想的弱洗脫液是價格略低的甲醇，而甲醇或者是含有甲醇的改性乙醇的引入使甘油三酯的整體分離度顯著降低。當(dāng)從異丙醇到乙腈的梯度運行時，操作壓力的大幅度增加明顯受限，不可取。采用提高色譜柱的操作溫度來降低溶劑粘度的方法已被證明是不可取的，因為色譜分離能力往往隨著溫度上升而衰減。
