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上海斯邁歐分析儀器有限公司
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為熱熔實驗提供更快的升溫速率-- 紫外可見分光光度計
2022-6-25 閱讀(204)
前言：升高溫度可誘導雙鏈核酸分離為單鏈。在一定溫度下，堿基對之間的氫鍵發(fā)生斷 裂。熱熔實驗利用了 DNA 腺嘌呤-胸腺嘧啶 (A=T) 與胞嘧啶 (GΞC) 或 RNA 腺 嘌呤 (A=U) 和胞嘧啶核苷酸之間氫鍵數(shù)的差異。由于 GΞC 核苷酸含 有三個氫鍵，解離所需熱能大于雙鍵對所需的熱能。這表示含有更多 GΞC 對的 DNA 和 RNA 要在更高的溫度下才能熔解。熔解溫度 (Tm) 可指示樣品中的堿基組成（GΞC 與 A=T/U=T 的比例）。 使用紫外-可見分光光度法測定熔點，利用的是單鏈核酸在 260 nm 處的吸光度高于 雙鏈核酸的原理[1]。圖 1 顯示了使用小干擾 RNA (siRNA) 樣品的示例，與 25 °C 相 比，85 °C 下 260 nm 處的吸光度明顯更高。
通常通過測定 260 nm 處的吸光度來進行熱熔實驗。然后在 受控 pH 和離子強度條件下逐漸升高樣品溫度。通常以每分鐘 0.5 °C 的速率升溫[2, 3, 4]。需要非常慢的升溫速率才能確保準確 且可重現(xiàn)的數(shù)據。然而，緩慢的升溫速率也意味著實驗需要 很長時間。例如，以每分鐘 0.5 °C 的速率將溫度從 20 °C 升至 95 °C 需要 2.5 小時。實驗室通常需要重復這些測量以確保可 重現(xiàn)的結果，因此完整的熱熔實驗可能十分耗時。 有很多方法可以縮短熱熔測量所需時間。例如，一些儀器能夠 將實驗分成幾個階段，每個階段使用不同的升溫速率?？梢栽?開始和結束階段使用快速升溫速率，在樣品變性的溫度范圍內 使用較慢的升溫速率。 分光光度儀器的最新進展大大縮短了熱熔測量所需的時間，溫 度精度比以往更高。Agilent Cary 3500 多區(qū)控溫紫外-可見分 光光度計使用集成的比色皿內溫度探頭，可在實驗過程中準確 控制溶液溫度。多池支架內置于儀器中，使用無水、風冷的帕 爾帖控溫模塊將樣品溫度控制在 0–110 °C 之間。 本研究使用 Cary 3500 多區(qū)控溫紫外-可見分光光度計評估升 溫速率對 siRNA 樣品熔解溫度 (Tm) 計算值的影響。
實驗部分 樣品 siRNA 樣品由安捷倫核酸解決方案事業(yè)部提供。使用含 100 mmmol/L NaCl、0.1 nmmol/L EDTA 和 10 mmmol/L 磷 酸鈉的緩沖溶液配制 ≈ 0.3 mg/mL 的 siRNA 溶液，調節(jié)至 pH 7.0。 使用標準 3.5 mL 體積、10 mm 光程的石英比色皿。使用純磷 酸鹽緩沖液作為參比溶液。 儀器和方法 所有測量均采用 Cary 3500 多區(qū)控溫紫外-可見分光光度計。 方法參數(shù)見表 1。 研究期間改變的參數(shù)是升溫速率。共使用了八個升溫速 率：0.5、1、5、10、15、20、25 和 30 °C/min。 所有測量均使用至少三個平行樣品在相同條件下同步進行測 量。將每個樣品比色皿與參比樣配對放置在八位多池支架 中。將比色皿內溫度探頭插入每個樣品比色皿中（圖 2），該 探頭可用于控制實驗溫度。
結論 采用 Cary 3500 多區(qū)控溫紫外-可見分光光度計以八個不同 的升溫速率測量同一個 siRNA 樣品的熔點。各個升溫速率下 測得的熔點誤差均在 ±1 °C 范圍內，表示實驗室可以使用比 0.5 °C/min 的常規(guī)方案更快的升溫速率。使用更快的升溫速率 可以在不影響結果的前提下大大縮短實驗時間。本研究表明， 使用 Cary 3500 可以在約 5 分鐘內測定之前需要 2.5 小時才能 完成的實驗。至少同步進行三次重復測定同樣能夠大大節(jié)省分 析時間。 使用較快的升溫速率可擴展到其他紫外-可見吸光度隨溫度變 化的測量，為進行控溫實驗的實驗室提供了顯著的分析效率優(yōu) 勢。能夠同步測量所有八個比色皿位置，進一步提升了致力于 研究液體樣品對溫度變化響應的實驗室的分析效率。
