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伊萊博生物科技（上海）有限公司
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更新時間：2025-07-24 15:50:23瀏覽次數(shù)：13
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1. KO first小鼠模型構(gòu)建方法
KO first（Conditional Ready）小鼠模型是一種多用途的基因敲除模型，通過在目的基因的特定位置插入特定的重組位點（如LoxP和FRT），實現(xiàn)全基因敲除或條件性基因敲除。以下是構(gòu)建KO first小鼠模型的主要步驟：
設(shè)計靶向載體：在目的基因的外顯子兩側(cè)插入方向相同的LoxP位點，并在靶片段5’端內(nèi)含子中插入一個帶有FRT位點的SA-IRES-reporter片段。這個片段包含一個報告基因（如GFP）和一個抗性基因（如Neo）。
構(gòu)建Flox小鼠：通過同源重組技術(shù)，將靶向載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）中，然后將這些細(xì)胞注射到囊胚中，形成嵌合體小鼠。通過交配，獲得攜帶LoxP位點的Flox小鼠。
全基因敲除：將Flox小鼠與全身表達(dá)Cre的小鼠交配，Cre重組酶會識別LoxP位點并切除目標(biāo)基因，同時保留報告基因和抗性基因，得到全基因敲除的小鼠。
條件性基因敲除：將Flox小鼠與Flp工具鼠交配，F(xiàn)lp重組酶會識別FRT位點并切除SA-IRES-reporter片段，得到常規(guī)的Flox小鼠。然后將Flox小鼠與組織特異性的Cre工具鼠交配，實現(xiàn)條件性基因敲除。
2. 基因型鑒定
PCR鑒定：通過設(shè)計特異性引物，對小鼠基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，檢測LoxP位點、FRT位點、報告基因和抗性基因的存在。
Southern blotting：通過限制性酶切和探針雜交，檢測基因整合情況和敲除情況。
3. 應(yīng)用：具有廣泛的應(yīng)用，主要包括以下幾個方面：
研究基因功能：通過全基因敲除或條件性基因敲除，研究基因在特定組織或發(fā)育階段的功能。
疾病模型構(gòu)建：模擬人類疾病的發(fā)生發(fā)展，研究疾病機制。例如，通過敲除腫瘤抑制基因構(gòu)建腫瘤模型。
藥物篩選和驗證：評估藥物的療效和安全性，驗證藥物靶點的有效性。
基因表達(dá)示蹤：通過報告基因的表達(dá)，示蹤目標(biāo)基因的表達(dá)情況，方便基因研究。
4. 優(yōu)勢與局限性
優(yōu)勢：多用途：既可以實現(xiàn)全基因敲除，也可以實現(xiàn)條件性基因敲除。
靈活性：通過選擇不同的Cre和Flp工具鼠，可以靈活地控制基因敲除的時間和空間。
局限性：設(shè)計復(fù)雜：需要對基因進(jìn)行全面分析，避免基因敲除導(dǎo)致內(nèi)源性基因表達(dá)下調(diào)或截短蛋白的表達(dá)。
周期較長：構(gòu)建過程涉及多個步驟，包括ES細(xì)胞打靶、嵌合體小鼠的獲得和交配等，整個過程可能需要9-12個月。
