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伊萊博生物科技（上海）有限公司
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更新時間：2025-06-26 16:00:53瀏覽次數(shù)：92
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1. 微生物基因編輯常用基因編輯技術(shù)
A. CRISPR-Cas系統(tǒng)（最主流）
工具組成：
Cas蛋白：常用Cas9（化膿鏈球菌）、Cas12a（更小，適合緊湊基因組）。
sgRNA：引導(dǎo)Cas蛋白靶向特定DNA序列。
修復(fù)模板（HDR）：用于精確插入或替換基因。
優(yōu)勢：高效、多靶點(diǎn)編輯、適用于多種微生物。
適用微生物：細(xì)菌（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌）、真菌（酵母、絲狀真菌）、古菌。
B. 傳統(tǒng)同源重組（HR）
原理：通過同源臂介導(dǎo)的DNA重組實(shí)現(xiàn)基因替換或敲除。
適用場景：CRISPR效率低的微生物（如某些乳酸菌）。
關(guān)鍵步驟：構(gòu)建含同源臂的線性DNA片段，電轉(zhuǎn)化或接合轉(zhuǎn)移。
C. 其他工具
Base Editing（堿基編輯）：無需DSB，直接轉(zhuǎn)換C→T或A→G（如CRISPR-Cas9-脫氨酶融合蛋白）。
Prime Editing：更精準(zhǔn)的插入、缺失和點(diǎn)突變。
轉(zhuǎn)座子/噬菌體整合：適用于無高效編輯工具的微生物（如某些放線菌）。
2. 微生物基因編輯實(shí)驗(yàn)流程（以CRISPR-Cas9為例）
A. 設(shè)計階段
靶點(diǎn)選擇：
使用工具（如CRISPRko）設(shè)計sgRNA，避免脫靶。
目標(biāo)序列要求：NGG PAM（Cas9）或TTTV PAM（Cas12a）。
修復(fù)模板設(shè)計（如需敲入）：
同源臂長度：細(xì)菌（~500 bp），真菌（~1 kb）。
B. 載體構(gòu)建
表達(dá)系統(tǒng)：
質(zhì)粒載體：適合短期編輯（需抗性篩選）。
染色體整合：穩(wěn)定表達(dá)Cas9（如大腸桿菌BL21(DE3)-Cas9）。
遞送方式：
電轉(zhuǎn)化（細(xì)菌）、PEG介導(dǎo)（真菌）、接合轉(zhuǎn)移（難以轉(zhuǎn)化的菌種）。
C. 編輯與篩選
轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染：將CRISPR組件導(dǎo)入微生物。
篩選：
抗性標(biāo)記：如卡那m素（KanR）、氯m素（CmR）。
表型篩選：熒光報告基因（GFP）、營養(yǎng)缺陷型補(bǔ)償（如leu2-）。
驗(yàn)證：
PCR+測序：確認(rèn)目標(biāo)編輯。
功能驗(yàn)證：如酶活檢測、生長曲線。
3. 應(yīng)用領(lǐng)域
A. 基礎(chǔ)研究
基因功能研究：必需基因敲除、啟動子替換。
調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析：如細(xì)菌雙組分系統(tǒng)突變體構(gòu)建。
B. 工業(yè)生物技術(shù)
代謝工程：
大腸桿菌生產(chǎn)胰島素、琥珀酸。
酵母合成青h素、β-胡蘿卜素。
酶改造：定向進(jìn)化提高酶熱穩(wěn)定性（如Taq DNA聚合酶）。
C. 醫(yī)學(xué)應(yīng)用
疫苗開發(fā)：減毒活疫苗（如刪除致病基因的結(jié)核分枝桿菌）。
抗菌策略：
編輯益生菌（如乳酸菌）遞送治療分子。
噬菌體編輯靶向耐藥菌（如MRSA）。
D. 環(huán)境修復(fù)
工程菌：降解污染物（如Pseudomonas編輯降解石油）。
4. 挑戰(zhàn)與解決方案
A. 編輯效率低
優(yōu)化方案：
調(diào)整Cas蛋白表達(dá)量（避免毒性）。
使用ssDNA修復(fù)模板（提高HDR效率）。
B. 遞送困難
解決方案：
原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（真菌）。
噬菌體包裹CRISPR組件（針對頑固細(xì)菌）。
C. 脫靶效應(yīng)
控制方法：
高保真Cas變體（如Cas9-HF1）。
全基因組測序驗(yàn)證。
5. 前沿技術(shù)
多基因編輯：同步敲除/敲入多個基因（如酵母基因組精簡計劃）。
無痕編輯：通過FLP/FRT或Cre-loxP刪除篩選標(biāo)記。
體內(nèi)編輯：口服CRISPR膠囊靶向腸道菌群（如治療苯b酮尿癥）。
6. 實(shí)驗(yàn)示例：大腸桿菌基因敲除
設(shè)計sgRNA：靶向lacZ基因（5'-GCTATGACCATGATTACGA-3' + NGG）。
構(gòu)建質(zhì)粒：將sgRNA和Cas9克隆至pTarget載體。
電轉(zhuǎn)化：導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，涂布Amp平板。
驗(yàn)證：
藍(lán)白斑篩選（lacZ-菌落為白色）。
PCR擴(kuò)增靶區(qū)域并測序。
