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SpCas9來源于S.pyogenes菌株，是依賴于crRNA和tracrRNA(或連接后形成的sgRNA)引導(dǎo)的DNA內(nèi)切核酸酶，在靶標(biāo)雙鏈DNA存在PAM(NGG)的情況下，特異地切割靶標(biāo)雙鏈DNA，使DNA雙鏈斷裂并生成平末端。PAM對于SpCas9的識別和切割都是必需的，其切割位點(diǎn)位于目標(biāo)序列(target sequence)內(nèi)，離PAM區(qū)3個堿基。SpCas9酶的HNH和RuvC結(jié)構(gòu)域分別負(fù)責(zé)切割靶標(biāo)雙鏈DNA中與sgRNA配對和非配對的鏈。本產(chǎn)品中，SpCas9的H840被突變?yōu)?/span>A，從而使其HNH結(jié)構(gòu)域失活。因此，SpCas9 H840A Nickase只有RuvC結(jié)構(gòu)域有剪切活性，僅剪切靶標(biāo)dsDNA中的NTS鏈，形成單鏈切刻。
產(chǎn)品組分
組分 | 32120-01（100 pmoL） | 32120-03（1000 pmoL） |
SpCas9 H840A Nickase(10uM）a | 100 pmoL | 1000 pmoL |
10×TOLO Buffer 3 | 1ml | 1ml |
a:SpCas9 H840A Nickas為10uM，即10pmol/ul, 100pmo規(guī)格l的總體積為10ul,1000pmo規(guī)格l的總體積為100ul.
實(shí)驗(yàn)案例
1.SpCas9 H840A Nickase對超螺旋DNA靶標(biāo)的切刻實(shí)驗(yàn):為了驗(yàn)證SpCas9 H840A Nickase可以剪切特異靶標(biāo)dsDNA中的NTS鏈并產(chǎn)生單鏈切口，我們使用帶有靶位點(diǎn)的超螺旋DNA(cccDNA)作為剪切底物，將SpCas9 H84OA Nickase、sgRNA和target cccDNA加入剪切反應(yīng)體系，在37℃靜置孵育30 min，然后85℃滅活5 min。切刻后的開環(huán)DNA(ocDNA)較原始的cccDNA遷移速率減慢，因此，可以用1%的瓊脂糖凝膠電泳(150V，20 min)檢測樣本條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SpCas9 H840A Nickase可在sgRNA引導(dǎo)下使target cccDNA產(chǎn)生單鏈切刻。
設(shè)計(jì)SpCas9 H840A Nickase的sgRNA
SpCas9 H840A Nickase的sgRNA可參照以下序列設(shè)計(jì)(PMID:26545076):
5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG-3’，(下劃線表示與特異靶標(biāo)序列互補(bǔ)配對的spacer區(qū))。
