6
AacCas12b 核酸酶(又名 C2c1)是依賴于 RNA 介導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶，在靶標(biāo) DNA 存在 PAM(TTN)的情況
下，可特異地剪切靶標(biāo)雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成粘性末端。而 AacCas12b 特異地剪切單鏈 DNA
靶標(biāo)不依賴 PAM 序列。此外，雙鏈或單鏈 DNA 靶標(biāo)均能激活 AacCas12b 的反式剪切活性(即旁路剪切活
性/附屬剪切活性)，即當(dāng) AacCas12b 酶與 sgRNA、靶標(biāo) DNA 結(jié)合形成三元復(fù)合物后，便會被激活針對非
特異序列 ssDNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列 ssDNA 切碎。
AacCas12b 來源于嗜酸耐熱菌 Alicyclobacillus acidoterrestris，zuijia剪切反應(yīng)溫度為 48℃。AacCas12b依賴于 crRNA 和 tracrRNA(或連接后形成的 sgRNA)引導(dǎo)。此外，AacCas12b 不僅可以應(yīng)用于靶標(biāo) dsDNA的剪切，其針對 ssDNA 的反式剪切活性還可用于靶標(biāo)核酸的快速檢測，詳見本公司開發(fā)的 HOLMESv2[1]核酸快檢技術(shù)。
產(chǎn)品組分
組分 | 32116-01 (100 pmol) | 32116-03 (1,000 pmol) |
AacCas12b Nuclease (10 μM) a | 100 pmol | 1,000 pmol |
10 × HOLMES Buffer 1 | 1 mL | 1 mL |
Control Target DNA and sgRNAb | 5 μL | 5 μL |
a. AacCas12b Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規(guī)格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規(guī)格的總體積為 100 μL；
b. Control Target DNA and sgRNA 應(yīng)保存于-80℃并避免反復(fù)凍融，必須在 6 個月內(nèi)使用，使用時建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應(yīng)體系
保存條件
Control Target DNA and sgRNA 于-80℃儲存，其余組分-20℃儲存；≤ 0℃運(yùn)輸。
活性定義
在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反應(yīng)體系中，48℃反應(yīng)條件下，1 min 內(nèi)剪切 1 pmolssDNA 探針?biāo)璧?Cas12b 酶量定義為 1 transU。
例：若某批次 AacCas12b 酶的反式剪切活性為 3.0 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 AacCas12b
酶可在 1 min 內(nèi)，在上述zhiding的反應(yīng)條件下，反式剪切 3 pmol ssDNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU
數(shù)值詳見各批號的 COA 檢測報告。
實驗流程
1. 順式剪切實驗
組分 | 體積 | 終濃度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM AacCas12b Nuclease | 0.5 μL | 250 nM |
10 μM sgRNA | 0.5 μL | 250 nM |
1 μM Target DNAc | 0.5 μL | 25 nM |
Nuclease-free water | Up to 20 μL |
c. 順式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。 l
*若用核酸電泳來分析順式剪切產(chǎn)物，建議使用 dsDNA靶標(biāo)，因為 ssDNA靶標(biāo)會被反式激活的 Cas12b 進(jìn)一步切碎。對于 20 μL 順式 剪切應(yīng)體系，推薦 target DNA的使用量為 100 ng～500 ng，且 target DNA片段長度在 300 bp～3 kb 范圍內(nèi)。不同長度 target DNA需要 的 Cas 酶和 sgRNA的量需要根據(jù) target DNA的摩爾量計算，建議保持 Cas 酶:sgRNA:target DNA的摩爾比為 10:10:1，以盡量確保 target DNA被剪切wanquan。
48℃反應(yīng) 30 min~1 h，85℃滅活 5 min，核酸電泳分析順式剪切產(chǎn)物。
2. 反式剪切實驗
組分 | 體積 | 終濃度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM AacCas12b Nuclease | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
10 μM sgRNA | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
1 μM Target DNAd | 0.5~5 μL | 25~250 nM |
10 μM ssDNA Reporter | 0.05~0.5 μL | 25~250 nM |
Nuclease-free water | Up to 20 μL |
d. 反式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。 l
*反式剪切體系中各組分的用量可以根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整，用量較少時可先將各組分稀釋后加入體系，AacCas12b Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er1 稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的 Cas12 酶長期保存，請使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），sgRNA、 Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋，但極低濃度的 Target DNA（例如 LOD 實驗）建議用 0.1% Tween 20 稀釋 并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。 l
*反式剪切體系中探針的用量和預(yù)期反應(yīng)到達(dá)平臺期的時間可參考各批號Cas 酶transU的具體數(shù)值，詳見本公司提供的 COA檢測報告。
實時熒光定量 PCR 儀檢測熒光信號，48℃反應(yīng)，每 30 sec 采集一次熒光信號。
實驗結(jié)果
注意事項
1. Cas12b 的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12b 在 sgRNA 的引導(dǎo)下，特異性地剪切 target DNA。dsDNA 靶標(biāo)需帶有 PAM 位點(diǎn)，而 ssDNA 靶標(biāo)不依賴 PAM 位點(diǎn)。
2. Cas12b 的反式剪切(trans-cleavage)：當(dāng) target DNA 存在時，Cas12b/sgRNA 與 target DNA 形成三元復(fù)合物(Cas12b/sgRNA/target DNA)，同時，Cas12b 被激發(fā)反式剪切活性，將反應(yīng)系中任意序列的單鏈 DNA切碎。
3. 利用本產(chǎn)品的反式剪切活性進(jìn)行分子診斷實驗，可參考本公司的 HOLMESv2[1]體系。
4. 為防止 RNase 污染，請保持實驗區(qū)干凈整潔，操作時需穿戴干凈的手套、口罩，實驗用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。
5. AacCas12b 酶對熱敏感，容易失活，應(yīng)全程冰上配置反應(yīng)體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。
6. 本產(chǎn)品僅供科研使用。
