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腎素是一種酶，參與人體的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS），介導(dǎo)細(xì)胞外體積和動脈血管收縮。它調(diào)節(jié)血壓和電解質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。血管緊張素II收縮血管，導(dǎo)致血壓升高。它還會增加ADH和醛固酮的分泌，并刺激下丘腦激活口渴反射。腎素-血管緊張素系統(tǒng)過度活躍會導(dǎo)致血管收縮以及鈉和水的滯留。腎素已被確定為治療高血壓的有吸引力的靶標(biāo)。Amplite™腎素檢測試劑盒使用我們專有的Tide Fluor™3（TF3）/ Tide Quencher™3（TQ3）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）肽為高通量篩選腎素抑制劑和腎素活性提供了便捷的檢測方法。在FRET肽中，TF3的熒光被TQ3淬滅。通過腎素裂解為兩個獨(dú)立的片段后，TF3的熒光得以恢復(fù)，熒光信號可以通過熒光酶標(biāo)儀輕松監(jiān)測。該測定法比基于EDANS / DABCYL的測定法靈敏度高約50倍。借助Amplite™腎素檢測試劑盒，我們在100 µL反應(yīng)體積中檢測到低至1ng的腎素。但是，試劑盒中使用的腎素底物的選擇性尚未經(jīng)過*測試。由于基于肽的蛋白酶底物通常具有低選擇性，因此它也可能對其他蛋白酶有反應(yīng)。該測定法比基于EDANS / DABCYL的測定法靈敏度高約50倍。借助Amplite™腎素檢測試劑盒，我們在100 µL反應(yīng)體積中檢測到低至1ng的腎素。但是，試劑盒中使用的腎素底物的選擇性尚未經(jīng)過*測試。由于基于肽的蛋白酶底物通常具有低選擇性，因此它也可能對其他蛋白酶有反應(yīng)。該測定法比基于EDANS / DABCYL的測定法靈敏度高約50倍。借助Amplite™腎素檢測試劑盒，我們在100 µL反應(yīng)體積中檢測到低至1ng的腎素。但是，試劑盒中使用的腎素底物的選擇性尚未經(jīng)過*測試。由于基于肽的蛋白酶底物通常具有低選擇性，因此它也可能對其他蛋白酶有反應(yīng)。
| 熒光酶標(biāo)儀 | |
| 激發(fā) | 540納米 |
| 發(fā)射 | 590納米 |
| 隔斷 | 570納米 |
| 推薦板 | 純黑色 |
| 成分A：Renin Red™底物（100X） | 1小瓶（50 µL） |
| 組分B：腎素標(biāo)準(zhǔn) | 1小瓶（40 µg / mL，25 µL） |
| 組分C：測定緩沖液 | 1瓶（10毫升） |
- 準(zhǔn)備腎素標(biāo)準(zhǔn)和/或測試樣品（50 µL）
- 添加Renin Red™底物工作溶液（50 µL）
- 在37°C的培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘（用于終點(diǎn)讀數(shù)）
- 監(jiān)測Ex / Em = 540/590 nm的熒光強(qiáng)度
重要說明
開始實驗之前，請在室溫下解凍所有試劑盒組件。根據(jù)需要準(zhǔn)備含有腎素的生物樣品。
配制標(biāo)準(zhǔn)溶液
為了方便起見，請使用我們的系列稀釋計
向487.5 µL的測定緩沖液（組分C）中加入12.5 µL的40 µg / mL腎素標(biāo)準(zhǔn)溶液（組分B），得到1000 ng / mL的Renin標(biāo)準(zhǔn)溶液（Ren7）。取150 µL 1000 ng / mL Renin標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，以得到連續(xù)稀釋的Renin標(biāo)準(zhǔn)液（Ren6- Ren1）。
準(zhǔn)備工作溶液
將50μLRenin Red™底物（組分A）添加到5 mL的測定緩沖液（組分C）中，使總體積為5.05 mL。注意：應(yīng)立即使用Renin Red™底物。
程序
表1.黑色實心96孔微孔板中腎素標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局。Ren =腎素標(biāo)準(zhǔn)品（Ren1-Ren7，1至1000 ng / mL）; BL =空白對照；TS =測試樣品。
| BL | BL | TS | TS |
| 任1 | 任1 | ... | ... |
| 任2 | 任2 | ... | ... |
| 任3 | 任3 | ||
| 任4 | 任4 | ||
| 任5 | 任5 | ||
| 任6 | 任6 | ||
| 任7 | 任7 |
表2.每個孔的試劑組成。注意：腎素標(biāo)準(zhǔn)品僅用于陽性對照，不應(yīng)作為酶活性的定量標(biāo)準(zhǔn)品。
| 好 | 體積 | 試劑 |
| Ren1-Ren7 | 50微升 | 連續(xù)稀釋（1至1000 ng / mL） |
| BL | 50微升 | 分析緩沖液（組分B） |
| TS | 50微升 | 樣品 |
- 根據(jù)需要準(zhǔn)備含有腎素的生物樣品。
- 根據(jù)表1和表2中提供的布局準(zhǔn)備腎素標(biāo)準(zhǔn)品和/或含腎素的測試樣品。對于384孔板，每孔使用25 µL試劑代替50 µL。
- 如果要篩選腎素抑制劑，則將板在酶反應(yīng)所需的溫度（例如25°C或37°C）下預(yù)孵育10-15分鐘。
- 將50 µL（96孔）或25 µL（384孔）的Renin Red™底物工作溶液添加到樣品和測定板的對照孔中。
- 將反應(yīng)在37°C的培養(yǎng)箱中孵育30至60分鐘。
- 使用熒光板讀數(shù)器在Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 mn）下監(jiān)控?zé)晒鈴?qiáng)度。注意：試劑盒中使用的腎素底物的選擇性尚未經(jīng)過*測試。由于基于肽的蛋白酶底物通常具有低選擇性，因此它也可能對其他蛋白酶有反應(yīng)。一個人可能使用腎素特異性抑制劑進(jìn)行特異性測試，例如在存在腎素特異性抑制劑的情況下，底物的水解僅是由于非特異性蛋白酶的活性。總活性和在腎素特異性抑制劑存在下的活性之間的差異給出了樣品中的腎素活性。
對于動力學(xué)讀數(shù)：立即開始測量熒光強(qiáng)度，并每5分鐘連續(xù)記錄數(shù)據(jù)30至60分鐘。
對于終點(diǎn)讀數(shù)：將反應(yīng)液在37°C下孵育60分鐘或更長時間，如果可能，請避免光照。然后測量熒光強(qiáng)度。13530 Amplite™熒光法腎素檢測試劑盒 *紅色熒光* Amplite™ Fluorimetric Renin Assay Kit *Red Fluorescence* 100 tests 13601 Amplite™熒光法組蛋白去乙?；窰DAC活性檢測試劑盒 *綠色熒光* Amplite™ Fluorimetric HDAC Activity Assay Kit *Green Fluorescence* 200 Tests 13602 FAM-cAMP磷酸二酯酶PDE IV底物 *綠色熒光* FAM-cAMP PDE IV substrate *Green fluorescence* 0.5 umol 13603 TAMRA-cAMP磷酸二酯酶PDE IV底物 *紅色熒光* TAMRA-cAMP PDE IV substrate *Red fluorescence* 0.5 umol 13604 FAM-cGMP磷酸二酯酶PDE V底物 *綠色熒光* FAM-cGMP PDE V substrate *Green fluorescence* 0.5 umol 13605 TAMRA-cGMP磷酸二酯酶PDE V底物 *紅色熒光* TAMRA-cGMP PDE V substrate *Red fluorescence* 0.5 umol
