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基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）構(gòu)成了一族依賴鋅的內(nèi)肽酶，在細胞外基質(zhì)中發(fā)揮作用。這些酶負責結(jié)締組織的分解，在骨骼重塑，月經(jīng)周期和組織損傷修復(fù)中很重要。雖然很難評估MMP對某些病理過程的確切貢獻，但MMP似乎在關(guān)節(jié)炎的發(fā)展以及癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。MMP傾向于具有多種底物，大多數(shù)家族成員具有降解不同類型膠原蛋白以及彈性蛋白，明膠和纖連蛋白的能力。很難找到對單個MMP酶具有選擇性的底物。該試劑盒旨在檢查MMP酶的一般活性。當使用純化的MMP酶時，它也可用于篩選MMP抑制劑。我們還提供了一些高活性的MMP酶。
| 熒光酶標儀 | |
| 激發(fā) | 490納米 |
| 發(fā)射 | 525納米 |
| 隔斷 | 515納米 |
| 推薦板 | 純黑色 |
| 組件A：MMP Green™底材 | 1小瓶（60 µL） |
| 組分B：APMA，4-氨基 | 1小瓶（20 µL，1 M） |
| 組分C：測定緩沖液 | 1瓶（20毫升） |
- 添加適當?shù)膶φ栈驕y試樣品（50 µL）
- 預(yù)孵育10-15分鐘
- 添加MMP Green™底物工作溶液（50 µL）
- 跳過孵育步驟以進行動力學讀數(shù)，或孵育30至60分鐘以進行終點讀數(shù)
- 監(jiān)測Ex / Em = 490/525 nm的熒光強度
重要說明
開始實驗之前，請在室溫下解凍所有試劑盒組件。根據(jù)需要準備包含生物樣品的MMP。
準備工作溶液
1. MMP Green™底物工作溶液：
將50μLMMP Green™底物（組分A）添加到5 mL的測定緩沖液（組分C）中，使總體積為5.05 mL MMP Green™底物工作溶液。
2. MMP稀釋：
如果使用純化的MMP，則在測定緩沖液（組分C）中將MMP稀釋至適當濃度。 注意： MMP在使用前需要激活。避免劇烈渦旋酶。
3.抑制劑和化合物的稀釋：
如果要篩選MMPs抑制劑，請根據(jù)需要稀釋已知的MMPs抑制劑和測試化合物。
程序
表1. 在96孔微孔板中適當?shù)膶φ眨ǜ鶕?jù)需要）和測試樣品的布局。SC =底物對照，IC =抑制劑對照，VC =載體對照，TC =測試化合物對照，TS =測試樣品。
| SC | SC | ... | ... |
| 我知道了 | 我知道了 | ... | ... |
| 風投 | 風投 | ||
| TC | TC | ||
| TS | TS | ||
| ... | ... | ||
| ... | ... | ||
表2.每個孔的試劑組成。一些強熒光測試化合物可能會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。使用測定緩沖液（組分C），使所有對照的總體積對于96孔板為50 µL，對于384孔板為20 µL。
| 好 | 體積 | 試劑 |
| SC | 50微升 | 分析緩沖液 |
| 我知道了 | 50微升 | MMP稀釋液和已知的MMPs抑制劑 |
| 風投 | 50微升 | MMP稀釋液和用于輸送測試化合物的載體 |
| TC | 50微升 | 含MMP的測定緩沖液和測試化合物 |
| TS | 50微升 | 用測試化合物稀釋MMP |
表3. MMP激活協(xié)議。
| MMPs | 通過治療激活 |
| MMP-1（膠原酶） | 在37°C下1 mM APMA（稀釋的組分C）3小時 |
| MMP-2（明膠酶） | 在37°C下1 mM APMA（稀釋的組分C）1小時 |
| MMP-3（基質(zhì)溶素） | 1 mM APMA（稀釋的組分C）在37°C下放置24小時 |
| MMP-7（基質(zhì)溶素，PUMP-1） | 1 mM APMA（稀釋的組分C）在37°C下放置20分鐘-1小時 |
| MMP-8（中性粒細胞膠原酶） | 在37°C下1 mM APMA（稀釋的組分C）1小時 |
| MMP-9（92 kDa明膠酶） | 在37°C下1 mM APMA（稀釋的組分C）2 h |
| MMP-10（基質(zhì)溶素2） | 1 mM APMA（稀釋的組分C）在37°C下放置24小時 |
| MMP-11（基質(zhì)溶素3） | 已經(jīng)處于活動狀態(tài)。無需APMA治療 |
| MMP-12（巨噬細胞彈性蛋白酶） | 1 mM APMA（稀釋的組分C）在37°C下放置2小時 |
| MMP-13（膠原酶3） | 在37°C下1 mM APMA（稀釋的組分C）40分鐘 |
| MMP-14 | 在37°C下1 mM APMA（稀釋的組分C）2-3小時 |
- 根據(jù)需要準備包含生物樣品的MMP。
- 要激活pro-MMP，請先以1：500的濃度將1 M APMA（組分B）與測定緩沖液（組分C）稀釋，以得到2 mM APMA工作溶液（2X）。 注意： APMA屬于有機汞。小心輕放！請按照當?shù)胤ㄒ?guī)進行處理。
接下來，將含有MMP的樣品或純化的MMP與等體積的2 mM APMA工作溶液（2X）孵育。孵育時間請參見表3。在實驗之前立即激活MMP。注意：將含酶的樣品放在冰上。避免劇烈渦旋酶?；罨傅拈L時間儲存??將使酶失活。為了酶的活化，優(yōu)選以較高的蛋白質(zhì)濃度活化。激活后，您可以進一步稀釋該酶。
- 根據(jù)表1和2中提供的布局準備對照和測試樣品（TS）。對于384孔板，每孔使用20 µL試劑代替50 µL。
- 如果要篩選MMPs抑制劑，則將板在酶反應(yīng)所需的溫度（例如25°C或37°C）下預(yù)孵育10-15分鐘。
- 將50 µL（96孔）或20 µL（384孔）的MMP Green™底物工作溶液添加到樣品和測定板的對照孔中。充分混合試劑。
- 使用熒光板讀數(shù)器在Ex / Em = 490/525 nm處監(jiān)控熒光強度。
對于動力學讀數(shù)：立即開始測量熒光強度，并每5分鐘連續(xù)記錄數(shù)據(jù)30至60分鐘。
對于終點讀數(shù)：將反應(yīng)在室溫下孵育30至60分鐘，如果可能，請避開光線。充分混合試劑，然后測量熒光強度。13510 Amplite™熒光法通用型基質(zhì)金屬蛋白酶MMP活性檢測試劑盒 *綠色熒光* Amplite™ Universal Fluorimetric MMP Activity Assay Kit *Green Fluorescence* 1 kit 13511 Amplite™熒光法通用型基質(zhì)金屬蛋白酶MMP活性檢測試劑盒 *紅色熒光* Amplite™ Universal Fluorimetric MMP Activity Assay Kit *Red Fluorescence* 1 kit 13512 Amplite™熒光法基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3活性檢測試劑盒 *綠色熒光* Amplite™ MMP-3 Activity Assay Kit *Green Fluorescence* 1 kit 13520 MMP Green™基質(zhì)金屬蛋白酶綠色熒光底物 MMP Green™ substrate 1 mg
