丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化作用的天然副產(chǎn)物，被廣泛用作確定氧化應(yīng)激和自由基形成的關(guān)鍵指標(biāo)。MDA的測(cè)量在歷*一直依賴于與硫代*酸（TBA）的反應(yīng)，以產(chǎn)生可以比色法或比色法測(cè)量的化合物。但是該測(cè)定法并非特定于MDA，而且還可以在90-100°C的酸性條件下進(jìn)行。已經(jīng)有許多商業(yè)化的ELISA試劑盒，這使其更加昂貴和乏味。Amplite™比色丙二醛（MDA）定量試劑盒提供了快速，方便的方法來(lái)測(cè)量MDA，而無(wú)需使用TBARS加熱步驟。MDA Blue™與MDA反應(yīng)生成藍(lán)色產(chǎn)物，該產(chǎn)物用酶標(biāo)儀在695 nm下測(cè)量。

1. 準(zhǔn)備測(cè)試樣品以及系列稀釋的MDA標(biāo)準(zhǔn)品（50 µL）

2. 添加MDA Blue™儲(chǔ)備溶液（10 µL）

3. 在室溫下孵育10-30分鐘

4. 添加反應(yīng)溶液（40 µL）

5. 在室溫下孵育30-60分鐘

6. 監(jiān)測(cè)OD在695 nm處的增加

重要說(shuō)明
開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)?jiān)谑覝叵陆鈨鏊薪M分。

儲(chǔ)備溶液的制備

除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. MDA標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mM）：
將100 µL ddH ₂ O加入MDA標(biāo)準(zhǔn)樣品瓶（組分C）中，制成100 mM MDA儲(chǔ)備溶液。

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

為了方便起見(jiàn)，請(qǐng)使用我們的系列稀釋計(jì)

向996 µL稀釋緩沖液（組分B）中加入4 µL 100 mM MDA標(biāo)準(zhǔn)液，得到400 µM MDA溶液（MDA7）。然后在稀釋緩沖液中進(jìn)行1：2的系列稀釋，以得到系列稀釋的MDA標(biāo)準(zhǔn)品（MDA6-MDA1）。

程序

表1.  MDA標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品在96孔透明底部微孔板中的布局。MDA = MDA標(biāo)準(zhǔn)品（MDA1-MDA7，6.25至400 µM），BL =空白對(duì)照，TS =測(cè)試樣品。

表2.每個(gè)孔的試劑組成。

1. 根據(jù)表1和2中提供的布局，準(zhǔn)備MDA標(biāo)準(zhǔn)品（MDA），空白對(duì)照（BL）和測(cè)試樣品（TS）。對(duì)于384孔板，每孔使用25 µL試劑，而不是50 µL。
   

2. 在MDA標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中加入10 µL MDA Blue™（組分A）溶液。對(duì)于384孔板，在每個(gè)孔中使用5 µL MDA Blue™溶液。
   

3. 將反應(yīng)混合物在室溫下孵育10-30分鐘。
   

4. 加入40 µL反應(yīng)溶液（組分D）使總測(cè)定體積為100 µL /孔。對(duì)于384孔板，請(qǐng)使用20 µL反應(yīng)溶液，總測(cè)定體積為50 µL /孔。
   

5. 將zui終反應(yīng)混合物在室溫下孵育30-60分鐘。
   

6. 使用吸光度板讀數(shù)器監(jiān)控吸光度，并在695?700 nm的OD下進(jìn)行路徑檢查校正。

數(shù)據(jù)分析

2.82.11.40.7400200- Formaldehyde- Glyceraldehyde- MDAData legendGenerated with Quest Graph™Aldehyde Concentration (uM)AbsHover mouse to interact

從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)（Abs）用作陰性對(duì)照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程式。該方程式可用于計(jì)算醛濃度樣品。我們建議您使用在線線性回歸計(jì)算器