GUS報(bào)導(dǎo)基因的定量檢測(cè)

GUS 能與底物MUG（分子量352.3，4-甲基傘型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反應(yīng)產(chǎn)生熒光物質(zhì)MU（分子量198.2，4-甲基傘型酮，4-methylumbelliferone）。MU的激發(fā)波長(zhǎng)為365nm，發(fā)射波長(zhǎng)為456，其含量可由熒光分光光度計(jì)測(cè)出。因此，我們可以根據(jù)單位質(zhì)量的植物總蛋白在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的熒光物質(zhì)的多少來(lái)定量的檢測(cè)GUS含量。

2.1 試劑配制

1)   1mol/L Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100ml水。

2)   1mol/L NaH2PO4 溶液：15.601g NaH2PO4 溶于100ml水。

3)   0.1M 磷酸緩沖液(PH7.0)：1mol/L Na2HPO4取5.77ml，1mol/L NaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。

4)   10％ SDS溶液：將90ml水稍微加熱，加10g SDS，攪拌溶解，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)PH至7.2，然后加水定容至100ml。

5)   0.5 M EDTA (PH8.0)：在80ml水中加入18.61g Na2EDTA•2H2O，用NaOH調(diào)PH至8.0（約需2g左右的固體NaOH），溶解后定容至100ml。

6)   GUS酶提取液：0.1M 磷酸緩沖液（PH7.0）取50ml；10% SDS取1ml； 0.5M EDTA(PH8.0)取2ml； Triton X-100取100ul；β-巰基乙醇100ul；用水定容至100ml。

7)   MUG底物：稱(chēng)8.8mg MUG，溶于10ml GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作濃度。

8)   反應(yīng)終止液（0.2 mol/L Na2CO3 ）：稱(chēng)2.12Na2CO3 ，用水定容到100ml。

9)   考馬斯亮藍(lán)G250溶液：考馬斯亮藍(lán)G250 10mg, 95%乙醇5m1, H3PO4 10ml，定容至l00ml，過(guò)濾后4℃保存。

10) １mg/ml BSA：20mg BSA，用GUS提取緩沖液定容至20ml。

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