吐露港（ToloBio）生物科技有限公司發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas12蛋白具備高效的“反式切割活性”，并基于該酶的優(yōu)勢(shì)研發(fā)了“福爾摩斯/HOLMES”核酸快速檢測(cè)平臺(tái)技術(shù)（one-Hour Low-cost Multipurpose highly Efficient System）。相比于傳統(tǒng)的分子診斷技術(shù)，基于CRISPR的HOLMES技術(shù)具備高靈敏、高特異、快速便捷等優(yōu)勢(shì)，被《Science》雜志譽(yù)為“下一代分子診斷技術(shù)”，在病原菌檢測(cè)、遺傳疾病篩查、精準(zhǔn)醫(yī)療等眾多領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力。

Cas12a

HOLMES檢測(cè)平臺(tái)^[1] 

·Cas12a家族是一類由單個(gè)crRNA介導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶

·在HOLMES核酸檢測(cè)系統(tǒng)中，Cas12a: crRNA: 靶標(biāo)DNA分子三元復(fù)合物的形成會(huì)激活Cas12a的反式剪切活性，可無(wú)差別的剪切反應(yīng)體系中的ssDNA分子，包括熒光標(biāo)記的ssDNA探針，從而產(chǎn)生大量的熒光信號(hào)，指示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性

Cas12b

HOLMESv2檢測(cè)平臺(tái)^[2]: 實(shí)現(xiàn)“一管法”和“絕對(duì)定量”

·采用嗜熱菌來(lái)源的Cas12b，比Cas12a更加耐熱，使核酸擴(kuò)增與靶標(biāo)檢測(cè)在同一管中進(jìn)行

·Cas12b: crRNA: 靶標(biāo)DNA三元復(fù)合物會(huì)激活Cas12b的反式剪切活性, 可無(wú)差別剪切反應(yīng)中的ssDNA分子，包括熒光標(biāo)記的ssDNA探針，從而產(chǎn)生大量的熒光信號(hào)，指示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性

·“一管法”體系既能保持對(duì)SNP和甲基化位點(diǎn)的分辨能力，又有效地避免氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)縮短檢測(cè)耗時(shí)

·通過(guò)結(jié)合HOLMESv2與digital PCR體系，可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)核酸的絕對(duì)定量

Cas13a

ToloBio擁有Cas12核酸檢測(cè)的方法學(xué)，并在2020年與美國(guó)科學(xué)院院士張鋒教授創(chuàng)立的Sherlock Biosciences就Cas12和Cas13診斷技術(shù)達(dá)成了中美市場(chǎng)的“交叉授權(quán)”合作。2022年11月，雙方又進(jìn)一步簽署了全球范圍內(nèi)的CRISPR診斷“交叉授權(quán)”合作協(xié)議，完成了ToloBio在CRISPR檢測(cè)領(lǐng)域方法學(xué)的全面布局。

HOLMES與SHERLOCK“雙劍合璧”^[3] 

·Cas13家族是一類由crRNA單獨(dú)介導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，可特異地識(shí)別并剪切靶標(biāo)ssRNA

·Cas13與crRNA、靶標(biāo)RNA形成三元復(fù)合物后，激活針對(duì)非特異序列ssRNA的“反式剪切活性”，將體系中的ssRNA切碎

·靶標(biāo)RNA濃度越高，體系反式剪切ssRNA報(bào)告探針的速度更快，釋放熒光信號(hào)到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間越短

Cas12f

不同靶ssDNA存在時(shí)，Cas12f1行使高效反式剪切活性的熒光信號(hào)結(jié)果

·Cas12f核酸酶是依賴sgRNA介導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶，傾向于特異結(jié)合并剪切靶標(biāo)ssDNA，且無(wú)需PAM位點(diǎn)

·Cas12f蛋白分子量普遍較?。s61.5kD），這是其主要優(yōu)勢(shì)之一

·與Cas12a/b功能類似，已有文獻(xiàn)報(bào)道，Cas12f對(duì)ssDNA靶標(biāo)中SNP位點(diǎn)的分辨能力高于Cas12^[4]。

CRISPR-Dx的優(yōu)勢(shì)

·多重：聯(lián)檢/降本；微流控/盤式芯片；色碼CARMEN；體系多重

·絕對(duì)定量：液相微球/固態(tài)微孔

·超靈敏/特異：1-2個(gè)拷貝可測(cè)；識(shí)別PCR灰區(qū)、SNP位點(diǎn)、甲基化位點(diǎn)

·超快速：1-5min內(nèi)完成剪切；恒溫?cái)U(kuò)增；One-Step；免擴(kuò)增；免提取核酸

·POCT/全自動(dòng)：LFA；LDT；全流程自動(dòng)化；便捷/成本低

其他CRISPR-Dx產(chǎn)品

Cas Protein表達(dá)質(zhì)粒

CRSIPR體系反式剪切報(bào)告探針

Reference:

[1] Li S, Cheng Q, Wang J, et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection[J]. Cell Discovery. 2018, 4: 20.

[2] Li L, Li S, Wu N, et al. HOLMESv2: A CRISPR-Cas12b-Assisted Platform for Nucleic Acid Detection and DNA Methylation Quantitation[J]. ACS Synthetic Biology. 2019, 8(10): 2228-2237.

[3] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442.

[4] Harrington LB, Burstein D, Chen JS, et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science. 2018;362(6416):839-842.