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南京億迅生物科技有限公司
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更新時間：2019-11-07 14:16:28瀏覽次數(shù)：480
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NAD-蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)檢測試劑盒
測定意義：
MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH，細菌中通常只含有NAD-MDH，在真核細胞中，NAD-MDH分布于細胞質(zhì)和線粒體中。
測定原理：
NAD-MDH催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致340nm處光吸收下降。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一、提取液60 mL×1瓶，在4℃保存；
試劑二、液體50 mL×1瓶，在4℃保存；
試劑三、粉劑×2支，-20℃保存；臨用前加入300μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存；
試劑四、粉劑×2支，-20℃保存；臨用前加入300μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存。
樣本測定的準備：
1、 細菌、細胞或組織樣品的制備 ：
細菌或培養(yǎng)細胞：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，棄上清，按照每200萬細菌或細胞加入400μL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復30次），8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一進行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定操作表：
試劑名稱（μL） | 測定孔 |
樣本 | 20 |
試劑二 | 760 |
試劑三 | 10 |
試劑四 | 10 |
將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，混勻后在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種），340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應1min后的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2。
注意事項：
1、粗酶液的提取必須在0℃ - 4℃中操做完成，以防止酶變性失活。
2、實驗時，試劑三、試劑四和樣本在冰上放置，以免變性和失活。試劑二37℃或25℃室溫放置。
NAD-蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)檢測試劑盒
