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實驗室中檢測大腸桿菌

一、調(diào)味品、醬腌制品中大腸菌群的測定

測定方法見“糕點、糖果中大腸菌群的測定”

二、

糕點、糖果中大腸菌群的測定

1、原理：大腸菌群是指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌注意來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。

食品中大腸菌群數(shù)是以每100ml（g）檢樣內(nèi)大腸菌群的zui可能數(shù)（The most probable number，簡稱MPN）表示。據(jù)此含義，所有食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的大腸菌群均應(yīng)以100ml（g）食品內(nèi)允許含有大腸菌群的實際數(shù)值為報告標(biāo)準(zhǔn)。檢查大腸菌群數(shù)，一方面能表明食品中有無糞便污染，另一方面還可以根據(jù)數(shù)量的多少，判定食品受污染的程度。

2、培養(yǎng)基及試劑：乳糖發(fā)酵管，伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB），生理鹽水，革蘭氏染色液，單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管。

3、器具及其他用品：恒溫箱、廣口瓶或三角瓶、吸量管、載玻片、水浴鍋、天平、顯微鏡、玻璃珠：直徑為5mm、酒精燈、均質(zhì)器或乳缽、溫度計、平皿：直徑為90mm、試管、接種針、試管架

4、大腸菌群的檢驗程序

5、檢樣稀釋

1）以無菌操作將檢樣25ml（g）放入含有225ml滅菌生理鹽水的滅菌三角瓶內(nèi)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨制成1：10均勻稀釋液。

2）用1ml滅菌吸量管吸取1：10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管使其混勻，制成1：100稀釋液。

3）另取1ml滅菌吸量管，按上述操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1ml滅菌吸量管。

4）根據(jù)糕點及糖果衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的要求或?qū)z樣污染情況的估計，選擇3個稀釋度，每個稀釋度接種3管。

6、發(fā)酵試驗

選擇3個稀釋度分別接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者，可用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1ml及1ml以下者，可用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每個稀釋度接種3管，置于（36±1）℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)（24±2）h，若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性；若有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行檢驗。

7、分離培養(yǎng)

將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置于35~37℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18~24h，然后取出觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色、鏡檢和乳糖復(fù)發(fā)酵試驗。

8、復(fù)發(fā)酵證實試驗

在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1~2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置于（36±1）℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（24±2）h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。

9、報告

根據(jù)實驗證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查表可知。報告每100ml（g）大腸菌群的zui可能數(shù)。

10、注意事項

挑取菌落：大腸菌群是一群腸道桿菌的總稱，大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等復(fù)雜多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。在實際工作當(dāng)中，為了提高大腸菌群的檢出率，應(yīng)當(dāng)熟悉其菌落的形態(tài)和色澤。在檢驗方法中我們選用伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落大多呈紫黑色有金屬光澤或無金屬光澤。菌落形態(tài)的其他方面（如菌落的大小、光滑與粗糙、邊緣完整情況、隆起情況、濕潤與干燥等）雖也應(yīng)注意，但不如色澤方法更為重要。挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率也有密切的關(guān)系。在實際工作中由于工作量大，通常只挑取一個菌落，但影響大腸菌群檢出率的因素很多，如食品種類、菌落色澤和形態(tài)、細(xì)菌種類等，只挑取一個菌落，由于幾率問題，很難避免假陰性的出現(xiàn)，尤其當(dāng)菌落不典型時。所以，挑取菌落時一定要挑取典型菌落，若無典型菌落則應(yīng)多挑取幾個菌落，以免出現(xiàn)假陰性。

程序：大腸菌群的國標(biāo)檢驗法采用三步法，即乳糖發(fā)酵、分離培養(yǎng)和證實試驗。第-一步乳糖發(fā)酵試驗是樣品的發(fā)酵結(jié)果，不是純菌的發(fā)酵試驗，所以初發(fā)酵陽性管，經(jīng)過后兩步，有可能成為陰性。大量檢驗數(shù)據(jù)證明，食品中大腸菌群檢驗程序的符合率、初發(fā)酵與證實試驗相差很大，不同食品三步法俄符合情況也不一致。一般來說，如果平板上有較多典型大腸菌群菌落，革蘭氏染色為陰性桿菌，即可做出判定。如果平板上典型菌落較少或均不夠典型，則應(yīng)多挑菌落做證實試驗，以免出現(xiàn)假陰性。只做一步初發(fā)酵，對某些食品來說誤差較大。這樣做，會有相當(dāng)部分的合格樣品被作為不合格樣品處理，應(yīng)予以注意。

產(chǎn)氣量：在糖發(fā)酵試驗中經(jīng)?？梢钥吹剑诎l(fā)酵套管內(nèi)存在極微小的氣泡（有時比小米粒還要?。?，類似這種情況能否算作產(chǎn)氣陽性，這是許多人經(jīng)常遇到的問題。大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵套管充滿氣體，少者產(chǎn)生比米粒還小的氣泡。一般來說，產(chǎn)氣量與大腸菌群檢出率呈正比的關(guān)系，但隨樣品種類而有不同，有米粒大小的氣泡的也有陽性檢出，另外，對未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵管是否均應(yīng)做陰性處理，根據(jù)大量實踐工作經(jīng)驗來看，對這種情況應(yīng)慎重考慮，有時會遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸無氣，但復(fù)發(fā)酵卻證實為大腸菌群陽性。有時套管內(nèi)雖無氣體，但在液面及管壁可以看到緩緩上升的小氣泡。所以對未產(chǎn)氣的發(fā)酵管有疑問時，可用手輕輕敲動或搖動試管，若有氣泡沿管壁上浮，即考慮為有氣體產(chǎn)生，應(yīng)做進一步試驗觀察。這種情況的陽性檢出率可達半數(shù)以上。

MPN檢索表：MPN表示樣品中活菌密度的估測。MPN檢索表是采用3個稀釋度9管法，稀釋度的選擇是基于對樣品中菌數(shù)的估測，較理想的結(jié)果應(yīng)是zui低稀釋度3管為陽性，而zui高稀釋度3管為陰性。如果無法估測樣品中的菌數(shù)，則應(yīng)做一定范圍的稀釋度。

在查閱MPN檢索表時，應(yīng)注意以下問題：在MPN檢索表第-一欄陽性管數(shù)下面列出的ml（g）是指原樣品（包括液體和固體）的量，并非稀釋后的量。對固體樣品更應(yīng)注意：如固體樣品1g經(jīng)10倍稀釋后，雖加入1ml量，但實際其中只含有0.1g樣品，故應(yīng)按0.1g計算。MPN檢索表中只提供三個稀釋度，即1ml（g）、0.1 ml（g）、0.01ml（g）；若改用10ml（g）、1 ml（g）、0.1ml（g）時，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。其余可類推。

三、

月餅中大腸菌群的測定（實訓(xùn)）

1、儀器及試劑

1）儀器：恒溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計、直徑為90mm的平皿、試管、廣口瓶或三角瓶、吸量管、載玻片、接種針、直徑為5mm的玻璃珠、酒精燈、試管架

2）試劑：單料乳糖膽鹽發(fā)酵管、雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、EC肉湯、磷酸鹽緩沖溶液、生理鹽水、革蘭氏染色液

2、操作步驟

以無菌操作將25g月餅放于含有225ml滅菌生理鹽水的滅菌三角燒瓶內(nèi)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨制成1：10均勻稀釋液。用1ml滅菌吸量管吸取1：10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管使其混勻，制成1：100稀釋液。另取1ml滅菌吸量管，按上述操作順序做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1ml滅菌吸量管。根據(jù)月餅污染情況的估計，選擇3個稀釋度，每個稀釋度接種3管。選擇3個稀釋度分別接種于乳糖發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者，可用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1ml或1ml以下者，可用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置于（36±1）℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)（24±2）h，若所有乳糖發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性；若有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行檢驗；將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置于35~37℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18~24h，然后取出觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色、鏡檢和乳糖復(fù)發(fā)酵試驗。在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1~2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置于（36±1）℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)（24±2）h，觀察產(chǎn)氣情況。

3、數(shù)據(jù)記錄及處理

1）將各步試驗結(jié)果填入下表中

2）根據(jù)上述結(jié)果查MPN檢索表，得出被檢樣品每100g中大腸菌群細(xì)菌的zui可能數(shù)。