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微生物鑒定

不同的細菌具有各自的*的酶系統(tǒng)，因而對底物的分解能力各異，其代謝的產(chǎn)物也不相同。這些代謝產(chǎn)物又具有不同的生物化學特性，可利用生物化學的方法測定這些代謝產(chǎn)物以鑒定細菌。掌握各種生化反應的原理和應用是細菌鑒定的基礎。生理生化特性的測定主要根據(jù)Shirling & Gottlieb《InternationalJournal of Systematic Bacteriology》中鑒定的有關試驗。

（一）碳水化合物代謝實驗


糖（醇、苷）類發(fā)酵實驗

（1）原理：
細菌分解糖的能力與該菌是否含有分解某種糖的酶密切相關，故分解糖的能力各不相同，細菌分解糖類后的終產(chǎn)物亦不一致，在含糖培養(yǎng)基中加入指示劑，若細菌分解糖則產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使培養(yǎng)基顏色改變，從而判斷細菌是否分解某種糖或其他碳水化合物
（2）基本培養(yǎng)基：
在培養(yǎng)基中加入0.5%～1%的糖類（單糖、雙糖、或者多糖）、醇類（甘露醇、肌醇）苷類（水楊苷、菊糖等）。培養(yǎng)基可為液體、半固體、固體或微量生化管幾種類型。
（3）實驗方法：
取某一種細菌的24h純培養(yǎng)物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖等培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)24h，觀察結果并記錄。
（4）結果判定：
如果接種進去的細菌可發(fā)酵某種糖或醇，則可產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基由紫色變成黃色，如果不發(fā)酵，則仍保持紫色。如，發(fā)酵的同時又產(chǎn)生氣體，則在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡。
（5）應用：
是鑒定細菌zui主要zui基本的實驗，特別是對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要。


氧化型與發(fā)酵型(O/F)的測定

（1）原理：
細菌在分解葡萄糖的過程中，必需有氧的參加的，稱為氧化型，細菌在分解葡萄糖的過程中，可以進行無氧降解的，稱為發(fā)酵型。發(fā)酵型細菌無論在有氧或者無氧的環(huán)境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的細菌稱為產(chǎn)堿型。這在區(qū)別微球菌與葡萄球菌、腸桿菌科成員中尤其有意義。
（2）培養(yǎng)基：
培養(yǎng)基蛋白胨2g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀0.3g，葡萄糖10g，瓊脂3g，1％溴麝香草酚藍3mL，蒸餾水1000mL。將蛋白胨、鹽、瓊脂和水混合，加熱溶解，校正pH至7.2，然后加葡萄糖和指示劑，加熱溶解；分裝試管，3～4mL/管；115℃，高壓蒸汽滅菌20min，取出后冷卻成瓊脂柱。
（3）實驗方法：
挑取18～24h的幼齡斜面培養(yǎng)物，穿刺接種，每種細菌接種兩管，于其中1管覆蓋1mL滅菌的液體石蠟，37℃培養(yǎng)24小時或更長時間。
（4）結果判定。


Β-半乳糖苷(ONPG)實驗

（1）原理：
有的細菌可以產(chǎn)生β一半乳糖苷酶，能分解鄰－硝基酚－β－D－半乳糖苷，而生成黃色的鄰－硝基酚，在很低濃度下也可以檢測出。
（2）培養(yǎng)基：
鄰硝基酚β-半乳糖苷0.6g，0.01mol／L pH7.5磷酸緩沖液1000mL，pH7.5的滅菌1%蛋白胨水300mL。先將前兩種成分混合溶解，過濾除菌，在無菌條件下與1％蛋白胨水混合，分裝試管，每管2～3mL，無菌檢驗后備用。
（3）實驗方法：
取一環(huán)細菌純培養(yǎng)物接種在ONPG培養(yǎng)基上置37℃培養(yǎng)1～3h或24h，如有β－半乳糖苷酶，會在3h內(nèi)產(chǎn)生黃色的鄰硝基酚；如無此酶，則在24h內(nèi)不變色。


七葉苷水解實驗

（1）原理：
有的細菌可以將七葉苷分解為七葉素和葡萄糖，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子反應，生成黑色的化合物，使培養(yǎng)基呈黑色。
（2）應用：
主要用于腸球菌與其它鏈球菌的鑒別，前者陽性，后者陰性，也可用于革蘭氏陰性桿菌及厭氧菌的鑒別。


甲基紅實驗

（1）原理：
細菌分解培養(yǎng)基中的葡萄糖產(chǎn)酸，當產(chǎn)酸量大，使培養(yǎng)基的pH降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑而變紅，為甲基紅試驗陽性。若細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)（如，醇、酮、醛、氣體和水等）則培養(yǎng)基的pH值仍在pH6.2以上，故加入甲基紅試劑呈黃色，為陰性。
（2）實驗方法：
一種細菌的24h培養(yǎng)物，接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)48～72h，取出后加甲基紅試劑3～5滴，凡培養(yǎng)液呈紅色者為陽性，橙色者為可疑，黃色者為陰性。
（3）應用：
主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性后者為陰性。


V-P實驗

（1）原理：
有些細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸, 丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中，被空氣中的氧氧化為二乙酰,二乙酰與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中精氨酸所含的胍基發(fā)生反應生成紅色的化合物。若培養(yǎng)基中的胍基含量過少，則可加入少量含胍基的化合物等。
（2）V-P試劑：
肌酸0.3%或原粉，40%的NaOH溶液。
（3）實驗方法：
接種實驗菌于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(與甲基紅實驗相同)中，每次兩個重復，置適溫培養(yǎng)2-6d，取培養(yǎng)液和40%NaOH等量相混，加入少許肌酸，10min如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色，即為實驗陽性反應，有時需要放置更長時間才出現(xiàn)紅色反應。
（4）應用：
本實驗常與甲基紅實驗一起用，因為前者陽性的細菌，后者通常為陰性。


（二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝實驗


明膠液化實驗

（1）原理：
某些可以產(chǎn)生一種胞外蛋白水解酶(明膠酶)，能使明膠分解為氨基酸，使明膠失去凝固能力而液化，因而使半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動的液體。
（2）實驗方法：
取18～24h的斜面培養(yǎng)物穿刺接種，并有兩支未接種的空白對照。
（3）結果觀察：
于30℃培養(yǎng)20天后觀察，明膠液化的為陽性。由于室溫下明膠培養(yǎng)基呈液狀，因此在觀察結果時，應將其放置于4℃的冰箱中30分鐘后拿出觀察。若明膠仍能全部凝固，為陰性，有部分或全部不能凝固為陽性。


吲哚實驗

（1）原理：
某些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，當加入吲哚試劑(對二甲氨基苯甲-醛)后則形成紅色的玫瑰吲哚。
（2）培養(yǎng)基：
蛋白胨水培養(yǎng)基。
（3）實驗方法：
將待檢菌接種于富含色氨酸的蛋白胨水培養(yǎng)基中，35℃孵育24~48h，沿試管壁慢慢加入吲哚試劑，觀察結果。
（4）結果：
于兩液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。
（5）應用：
主要用于腸桿菌科細菌的鑒定，如大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌等的鑒別。


硫化氫試驗

（1）原理：
某些細菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇亞鐵離子或鉛離子則結合形成黑色沉淀物(硫化鐵或硫化鉛沉淀)。
（2）實驗方法：
將待檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基中，于35℃孵育24h -48h，觀察有無黑色沉淀出現(xiàn)。
（3）結果：
培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮浴?/span>
（4）應用：
主要用于鑒別腸桿菌科中屬及種的鑒別，如沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛德華菌屬等為陽性，其它菌屬大多為陰性。但沙門菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株，如甲型副傷寒、仙臺、豬霍亂沙門菌等。


尿素分解試驗

（1）原理：
某些細菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性。
（2）培養(yǎng)基：
尿素培養(yǎng)基。
（3）實驗方法：
將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，于35℃孵育18~24h小時觀察結果。
（4）結果：
培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮浴?/span>
（5）應用：
主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細菌的鑒定。奇異變形桿菌和普通變形桿菌脲酶陽性，另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽性，而斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌陰性。