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上海宇淳生物科技有限公司

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Ca2+ Mg2+—ATP酶試劑盒,微板法
Ca2+ Mg2+—ATP酶試劑盒,微板法
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【簡單介紹】
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Ca2+ Mg2+—ATP酶試劑盒,微板法
Ca2+Mg2+-ATP 酶廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物和細(xì)胞中,可催化 ATP 水解生成 ADP 和無機(jī)磷。通過測(cè)定無機(jī)磷的量來確定該酶活性高低。

Ca2+ Mg2+—ATP酶試劑盒,微板法

Ca2+ Mg2+—ATP酶試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 Ca2+ Mg2+ - ATP 酶活性測(cè)定說明書 (貨號(hào):WS8580W 微板法 48 樣) 一、產(chǎn)品簡介: Ca2+Mg2+-ATP 酶廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物和細(xì)胞中,可催化 ATP 水解生成 ADP 和無機(jī)磷。通過測(cè)定無機(jī)磷的量來確定該酶活性高低。 二、所需的儀器和用品: 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 三、試劑盒的組成和配制: 【注】:全程操作需無磷環(huán)境;試劑配置用新的槍頭和玻璃移液器等,也可以用一次性塑料器皿, 避免磷污染。 四、Ca2+Mg2+-ATP 酶活性檢測(cè): 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定,了解本批樣品情況,熟悉實(shí)驗(yàn)流程,避免實(shí) 驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)! 1、樣本制備: ① 組織樣本: 稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液,進(jìn)行冰浴勻漿。 4×12000rpm 離心 10min,取 上清,置冰上待測(cè)。 【注】:若增加樣本量,可按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本: 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次); 12000rpm 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。 【注】:若增加樣本量,可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(104):提取液(mL)500~10001 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本:直接檢測(cè);若渾濁,離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè): ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 700nm,所有試劑解凍至室溫(25℃)。 ② 在 EP 管中依次加入: 試劑名稱(μL測(cè)定管 對(duì)照管 試劑一 100 100 樣本 100 試劑二 100 100 37℃ 孵育 20min 試劑三 40 40 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 提取液 90mL×1 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部,再加 20mL 提取液,混勻溶解備用。 試劑二 粉體×1 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部,再加 15mL 提取液,混勻溶解備用。 試劑三 液體 4mL×1 4℃保存 試劑四 A:粉體 mg×1 B:液體 2mL×1 4℃保存 臨用前在試劑 A 中加 1.8mL B 液,再 23.2mL 的蒸餾水,混勻溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 4℃保存 若重新做標(biāo)曲,則用到該試劑本試劑盒僅供科研使用 2 樣本 100 混勻,12000rpm,4℃離心 5min,上清液待測(cè) ③ 顯色反應(yīng): 五、結(jié)果計(jì)算: 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y = 0.6402x - 0.0034x 是標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量(μmol/mL, y A。 2、按蛋白濃度計(jì)算: 定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(A+0.0034)÷0.6404×V2]÷(V1×Cpr)÷T =15.93×(A+0.0034)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算: 定義:每小時(shí)每克組織分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[(A+0.0034)÷0.6404×V2]÷(W× V1÷V)÷T =15.93×(A+0.0034)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算: 定義:每小時(shí)每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h /104 cell)=[(A+0.0034)÷0.6404×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.032×(A+0.0034) 5、液體中 Ca2+Mg2+-ATPase 活力計(jì)算: 定義:每小時(shí)每毫升液體分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mL)=[(A+0.0034)÷0.6404×V2]÷V1÷T=15.93×(A+0.0034) V---加入提取液體積,1mL; V1---加入樣本體積,0.1mL ; V2---酶促反應(yīng)總體積,0.34mLT---反應(yīng)時(shí)間,1/3 小時(shí); W---樣本鮮重,g; 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬; Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附:標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程: 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液(5μmol/mL):標(biāo)準(zhǔn)品用 10mL 試劑一溶解。(母液需在兩天內(nèi)用)。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來調(diào)整 標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)顯色反應(yīng)階段測(cè)定管的加樣體系操作,根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 上清液 50 50 試劑四 200 200 混勻,室溫靜置 3min700nm 下讀取各管吸光值, A=A 測(cè)定-A 對(duì)照(每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照)。



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