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肌酸激酶(CK)試劑盒(定磷法),微板法
肌酸激酶(CK)試劑盒(定磷法),微板法
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【簡單介紹】
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肌酸激酶(CK)試劑盒(定磷法),微板法
肌酸激酶(CK,EC 2.7.3.2)主要存在于心臟、肌肉及腦等組織中,能可逆地催化 肌酸與 ATP 之間的轉(zhuǎn)磷?;磻?yīng),在能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮和 ATP 再生中有重要作用。

肌酸激酶(CK)試劑盒(定磷法),微板法

肌酸激酶(CK)試劑盒(定磷法),微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)活性測定說明書 (貨號:WS2880W 微板法 96 樣) 一、產(chǎn)品簡介: 肌酸激酶(CK,EC 2.7.3.2)主要存在于心臟、肌肉及腦等組織中,能可逆地催化 肌酸與 ATP 之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng),在能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮和 ATP 再生中有重要作用。 肌酸激酶(CK)催化三磷酸腺苷和肌酸生成磷酸肌酸,后者很快全部水解為磷酸, 但是三磷酸腺苷和生成的二磷酸腺苷仍很穩(wěn)定;通過定磷試劑來測定磷酸肌酸水解出 的磷酸含量檢測 CK 酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制: 【注】:全程操作需無磷環(huán)境;試劑配置用新槍頭和玻璃移液器等,避免磷污染。 三、所需的儀器和用品: 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、肌酸激酶(CK)活性檢測: 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定,了解本批樣品情況,熟悉實(shí)驗(yàn)流程,避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)! 1、樣本制備: ① 組織樣本:稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液,進(jìn)行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 10min,取上清,置冰上待測。 【注】:若增加樣本量,可按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本: 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次); 12000rpm 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。 【注】:若增加樣本量,可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(104):提取液(mL)為 500~10001 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本:直接檢測;若渾濁,離心后取上清檢測。 2、上機(jī)檢測: ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 700nm,所有試劑解凍至室溫(25℃)。 ② 試劑一和二和三可按照 20:20:210 預(yù)先配成混合液(現(xiàn)配現(xiàn)用);在 EP 管中依次加入: 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 提取液 120mL×1 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部,再加 4.2mL 蒸餾水溶解(可超聲溶解)。 試劑二 粉體 mg×1 -20℃用前甩幾下使試劑落入底部,再加 4.2mL 蒸餾水溶解(可超聲溶解)。 試劑三 液體 44mL×1 4℃保存 試劑四 液體 9mL×1 4℃保存 試劑五 A:粉體 mg×2 B:液體 6.5mL×1 4℃保存 臨用前在一瓶試劑 A 中加 3.24mL B 液,再加41.76mL蒸餾水混勻溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 4℃保存 若重新做標(biāo)曲,則用到該試劑 試劑名稱(μL測定管 對照管 試劑一 20 20 試劑二 20 20本試劑盒僅供科研使用 2 ③ 顯色反應(yīng),在 EP 管中直接加入: 【注】1.A 低于 0.01 可增加歩中樣本加樣體積 V1(如增至 100μL,則試劑三 相應(yīng)減少,總反應(yīng)體系不變),或延長 37℃ 孵育時(shí)間 T(如增至 60min); 或增加取樣質(zhì)量 W;則改變后的 V1 T W 需代入公式計(jì)算。 2.A 大于 1.2,可用蒸餾水對歩中上清液稀釋,則稀釋倍數(shù) D 代入公式計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算: 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y = 0.4836x - 0.0025x 是標(biāo)準(zhǔn)品摩爾濃度(μmol/mL, y A。 2、按蛋白濃度計(jì)算: 定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白產(chǎn)生 1μmol 磷酸肌酸的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(A+0.0025)÷0.4836×V2] ÷(V1×Cpr)÷T=28.12×(A+0.0025)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算: 定義:每小時(shí)每克組織產(chǎn)生 1μmol 磷酸肌酸的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[(A+0.0025)÷0.4836×V2]÷(W×V1÷V)÷T=28.12×(A+0.0025)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算: 定義:每小時(shí)每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞產(chǎn)生 1μmol 磷酸肌酸的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h /104 cell)=[(A+0.0025)÷0.4836×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.056×(A+0.0025) 5、按液體體積計(jì)算: 定義:每小時(shí)每毫升液體產(chǎn)生 1μmol 磷酸肌酸的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mL)=[(A+0.0025)÷0.4836×V2]÷V1÷T=28.12×(A+0.0025) V---加入提取液體積,1mL; V1---加入樣本體積,0.05mL ; W---樣本鮮重,g; V2---酶促反應(yīng)總體積,0.34mL; T---反應(yīng)時(shí)間,1/2 小時(shí); 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬; Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附:標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程: 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液(20μmol/mL):標(biāo)準(zhǔn)品用 1mL 蒸餾水溶解。(母液需在兩天內(nèi)用)。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品:0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2. μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來調(diào) 整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)③歩中顯色反應(yīng)階段測定管的加樣體系操作,根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 試劑三 210 210 樣本 50 37℃ 孵育 30min 試劑四 40 40 樣本 50 混勻,8000rpm,4℃離心 5min,上清液待測。 上清液 100 100 試劑五 400 400 混勻,室溫靜置 10min,若渾濁則可 8000rpm,4℃ 或室溫離心 5min,取 250μL 澄清液體至 96 孔板中, 700nm 下讀取各管吸光值,A=A 測定-A 對照(每 個(gè)樣本做一個(gè)自身對照)。



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