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輔酶Ⅱ NADP+/NADPH含量試劑盒,微板法
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【簡單介紹】
級別 其他
輔酶Ⅱ NADP+/NADPH含量試劑盒,微板法
煙*胺核苷酸的測定一直是細(xì)胞或組織在能量轉(zhuǎn)化和氧化還原狀態(tài)方面的研究熱點。

輔酶Ⅱ  NADP+/NADPH含量試劑盒,微板法

輔酶Ⅱ  NADP+/NADPH含量試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 輔酶ⅡNADP+/NADPH 含量試劑盒說明書 【貨號:WS2080W 微板法 48 (可測 48 NADP+48 NADPH)】 一、產(chǎn)品簡介: 煙*胺核苷酸的測定一直是細(xì)胞或組織在能量轉(zhuǎn)化和氧化還原狀態(tài)方面的研究熱點。 NADP+ /NADPH比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一,而且在生物物質(zhì)合成和抗 氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。 本試劑盒提供一種方便,快速的檢測方法,提供特異性提取液分別提取樣品中的 NADP+ NADPH,NADPH 在遞氫體作用下與一種高靈敏度的顯色劑反應(yīng)生成黃色水溶性甲瓚, 450nm 下檢測,得到 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脫氫酶特異性還原 NADP+NADPH,從而檢測 NADP+含量。 二、試劑盒組成和配制: 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液A 液體120mL×14℃保存 提取液B 液體120mL×14℃保存 試劑一 液體μL×1-20℃保存 用前用1.1mL蒸餾水溶解 試劑二 粉劑mg×1-20℃保存 用前用1.1mL蒸餾水溶解 試劑三 液體20mL×14℃保存 試劑四 EP1mL×14℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 EPμg×1-20℃保存 若重新做標(biāo)曲,則用到該試劑 三、所需的儀器和用品: 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、輔酶ⅡNADP+/NADPH 含量測定: 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定,了解本批樣品情況,熟悉實驗流程,避免實驗 樣本和試劑浪費! 由于 NADP+ NADPH 很不穩(wěn)定,較易降解,盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測。 1、樣本制備(制備完成的 NAD+ / NADH 待測上清液需盡快檢測,以免降解): 組織中 NADP+NADPH 的提取NADP +的提取:取約 0.1g 組織(水分充足樣本可取 0.5g),加入 1mL 提取液 A,冰浴研 磨,全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中(用提取液 A 補(bǔ)齊到 1mL),植物樣本于 95℃孵育 5min 或動物 樣本于 60℃孵育 30min,取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min;12000rpm 4 ℃離心 10min; 500μL 上清液至新 EP 管中,再加 V1 體積的提取液中和(可分次添加提取液 B,調(diào)至 PH 約中性,并記錄 V1);12000rpm,4℃離心 5min,取上清液置于冰上待測。 NADPH的提取:取約0.1g組織(水分充足樣本可取0.5g),加入1mL提取液B,冰浴研磨, 全部轉(zhuǎn)移到EP管中(用提取液B補(bǔ)齊到1mL),植物樣本于95℃孵育5min或動物樣本于60℃ 孵育30min,取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min12000rpm 4 ℃離心10min;取500μL上清 液至新EP管中,再加V2體積的提取液中和(可分次添加提取液A,調(diào)至PH約中性,并記 V2);12000rpm,4 ℃離心5min,取上清液置于冰上待測。 【注】:若測出值較低,可加大樣本取樣量,如增加到 0.2g 等,可做幾個梯度選擇適合本次實驗的樣本量。 ② 細(xì)胞或細(xì)菌中 NADP+NADPH 的提取NADP +的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi):取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液 A,冰浴研磨,全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中(用提取液 A 補(bǔ)齊到 1mL),于 60℃孵育 30min,取 出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min;12000rpm 4℃離心 10min;取 500μL 上清液至新 EP 本試劑盒僅供科研使用 2 中,再加 V1 體積的提取液中和(可分次添加提取液 B,調(diào)至 PH 約中性,并記錄 V1); 12000rpm,4℃離心 5min,取上清液置于冰上待測。 NADPH 的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi):取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取 B,冰浴研磨,全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中(用提取液 B 補(bǔ)齊 1mL),于 60℃孵育 30min,取 出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min12000rpm 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液至新 EP 中,再加 V2 體積的提取液中和(可分次添加提取液 A,調(diào)至 PH 約中性,并記錄 V2); 12000rpm 4 ℃離心 5min,取上清置于冰上待測。 【注】:若測出值較低,可加大樣本取樣量,如增至 1000 萬等,可做幾個梯度選適合本次實驗的樣本量。 ③ 液體中NADP+NADPH的提取: NADP +的提取:取約 0.1mL 液體,加入 1mL 提取液 A,冰浴研磨,全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中 (用提取液 A 補(bǔ)齊到 1.1mL),于 95℃孵育 5min,取出后立即冰浴(或放冰箱)5min; 12000rpm 4℃離心 10min;取 500μL 上清液至新 EP 管中,再加 V1 體積的提取液中和(可 分次添加提取液 B,調(diào)至 PH 約中性,并記錄 V1);12000rpm4℃離心 5min,取上清置冰 上待測。 NADPH的提取:取約0.1mL液體,加入1mL提取液B,冰浴研磨,全部轉(zhuǎn)移到EP管中(用 提取液B補(bǔ)齊到1.1mL),于95℃孵育5min,取出后立即冰浴(或放冰箱)5min;12000rpm 4 ℃離心10min;取500μL上清液至新EP管中,再加V2體積的提取液中和(可分次添加提 取液A,調(diào)至PH約中性,并記錄V2);12000rpm 4 ℃離心5min,取上清液置于冰上待測。 【注】:若測出值較低,可加大樣本取樣量,如增至 0.5mL 等,可做幾個梯度選擇適合本次實驗的樣本量。 2、 上機(jī)檢測① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,溫度設(shè)定 37℃,調(diào)節(jié)波長至 450nm。 ② 在 96 孔板中按下表依次加入試劑: 試劑名稱(μL測定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 150 37℃避光孵育 10min 試劑四 10 混勻, 37℃條件下,立即在 450nm 處測定吸光值 A1, 30min 后再測定 A2,ΔA=A2-A1【注】:若ΔA 過小,可加大樣本取樣質(zhì)量 W;或增加樣本量 V1(由 20 增至 40μL,則試劑三相應(yīng)減少), 或延長反應(yīng)時間(如:60min 或更長);則改變后的相應(yīng)變量需代入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算: 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式:y =8.6631x - 0.0013x NADPH 摩爾質(zhì)量(nmol),y ΔA。本試劑盒僅供科研使用 3 2、NADP+含量的計算: (1)按樣本鮮重計算: NADP+ (nmol/g 鮮重)=[(A+0.0013)÷8.6631]÷(W÷2×V ÷V3) =11.54×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V1)÷W (2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算: NADP+ (nmol/104 cell)=[(A+0.0013)÷8.6631]÷(500÷2×V ÷V3) =0.023×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V1) (3)液體中 NADP+含量計算: NADP+含量(nmol/mL)=[(A+0.0013)÷8.6631]÷(V ÷2×V ÷V3) =115.43×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V1) 3NADPH 含量的計算: (1)按樣本鮮重計算: NADPH (nmol/g 鮮重)=[(A+0.0013)÷8.6631]÷(W÷2×V ÷V4) =11.54×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V2)÷W (2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算: NADPH (nmol/104 cell)=[(A+0.0013)÷8.6631]÷(500÷2×V ÷V4) =0.023×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V2) (3)液體中 NADPH 含量計算: NADPH 含量(nmol/mL)=[(A+0.0013)÷8.6631]÷(V ÷2×V ÷V4) =115.43×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V2) V ---加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL; V ---所取液體樣本體積:0.1mL; V3---NADP+提取液體積:0.5mL 提取液 A+ V1mL 提取液 B=0.5+V1mLV4---NADPH 提取液體積:0.5mL 提取液 B+ V2mL 提取液 A=0.5+V2mL; W---樣本質(zhì)量,g; 500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬; NADPH 分子量---745.4; 附:標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程: 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液(1μmol/mL):向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸餾水(NADPH 太穩(wěn)定,取出 NADPH 后請盡快使用。如果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不理想,很有可能是標(biāo)準(zhǔn) 品發(fā)生了降解)。 2 把母液稀釋成五個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品:0, 1, 2, 3, 4, 5 nmol/mL。也可根據(jù)實際樣本來 調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)測定管加樣表操作,根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。



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