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輔酶Ⅱ  NADP+/NADPH含量試劑盒,微板法

輔酶Ⅱ  NADP+/NADPH含量試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 輔酶ⅡNADP+/NADPH 含量試劑盒說明書 【貨號：WS2080W 微板法 48 樣(可測 48 個 NADP+，48 個 NADPH）】 一、產(chǎn)品簡介： 煙*胺核苷酸的測定一直是細胞或組織在能量轉化和氧化還原狀態(tài)方面的研究熱點。 NADP+ /NADPH比值不僅是細胞氧化還原態(tài)的主要標志之一，而且在生物物質合成和抗 氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。 本試劑盒提供一種方便，快速的檢測方法，提供特異性提取液分別提取樣品中的 NADP+ 和 NADPH，NADPH 在遞氫體作用下與一種高靈敏度的顯色劑反應生成黃色水溶性甲瓚， 在 450nm 下檢測，得到 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脫氫酶特異性還原 NADP+為 NADPH，從而檢測 NADP+含量。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液A 液體120mL×1瓶 4℃保存 提取液B 液體120mL×1瓶 4℃保存 試劑一 液體μL×1支 -20℃保存 用前用1.1mL蒸餾水溶解 試劑二 粉劑mg×1支 -20℃保存 用前用1.1mL蒸餾水溶解 試劑三 液體20mL×1瓶 4℃保存 試劑四 EP管1mL×1支 4℃保存 標準品 EP管μg×1支 -20℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、輔酶ⅡNADP+/NADPH 含量測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 由于 NADP+ 和 NADPH 很不穩(wěn)定，較易降解，盡量使用新鮮樣品進行檢測。 1、樣本制備（制備完成的 NAD+ / NADH 待測上清液需盡快檢測，以免降解）： ① 組織中 NADP+和 NADPH 的提取： NADP +的提取：取約 0.1g 組織（水分充足樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液 A，冰浴研 磨，全部轉移到 EP 管中（用提取液 A 補齊到 1mL），植物樣本于 95℃孵育 5min 或動物 樣本于 60℃孵育 30min，取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min；12000rpm 4 ℃離心 10min； 取 500μL 上清液至新 EP 管中，再加 V1 體積的提取液中和（可分次添加提取液 B，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V1）；12000rpm，4℃離心 5min，取上清液置于冰上待測。 NADPH的提取：取約0.1g組織（水分充足樣本可取0.5g），加入1mL提取液B，冰浴研磨， 全部轉移到EP管中（用提取液B補齊到1mL），植物樣本于95℃孵育5min或動物樣本于60℃ 孵育30min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清 液至新EP管中，再加V2體積的提取液中和（可分次添加提取液A，調(diào)至PH約中性，并記 錄V2）；12000rpm，4 ℃離心5min，取上清液置于冰上待測。 【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增加到 0.2g 等，可做幾個梯度選擇適合本次實驗的樣本量。 ② 細胞或細菌中 NADP+和 NADPH 的提取： NADP +的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)：取約 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液 A，冰浴研磨，全部轉移到 EP 管中（用提取液 A 補齊到 1mL），于 60℃孵育 30min，取 出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min；12000rpm 4℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管本試劑盒僅供科研使用 2 中，再加 V1 體積的提取液中和（可分次添加提取液 B，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V1）； 12000rpm，4℃離心 5min，取上清液置于冰上待測。 NADPH 的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)：取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取 液 B，冰浴研磨，全部轉移到 EP 管中（用提取液 B 補齊 1mL），于 60℃孵育 30min，取 出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min；12000rpm 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管 中，再加 V2 體積的提取液中和（可分次添加提取液 A，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V2）； 12000rpm 4 ℃離心 5min，取上清置于冰上待測。 【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增至 1000 萬等，可做幾個梯度選適合本次實驗的樣本量。 ③ 液體中NADP+和NADPH的提?。?NADP +的提取：取約 0.1mL 液體，加入 1mL 提取液 A，冰浴研磨，全部轉移到 EP 管中 （用提取液 A 補齊到 1.1mL），于 95℃孵育 5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min； 12000rpm 4℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管中，再加 V1 體積的提取液中和（可 分次添加提取液 B，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V1）；12000rpm4℃離心 5min，取上清置冰 上待測。 NADPH的提取：取約0.1mL液體，加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部轉移到EP管中（用 提取液B補齊到1.1mL），于95℃孵育5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清液至新EP管中，再加V2體積的提取液中和（可分次添加提 取液A，調(diào)至PH約中性，并記錄V2）；12000rpm 4 ℃離心5min，取上清液置于冰上待測。 【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增至 0.5mL 等，可做幾個梯度選擇適合本次實驗的樣本量。 2、 上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，溫度設定 37℃，調(diào)節(jié)波長至 450nm。 ② 在 96 孔板中按下表依次加入試劑： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 150 37℃避光孵育 10min 試劑四 10 混勻， 37℃條件下，立即在 450nm 處測定吸光值 A1， 30min 后再測定 A2，ΔA=A2-A1。 【注】：若ΔA 過小，可加大樣本取樣質量 W；或增加樣本量 V1（由 20 增至 40μL，則試劑三相應減少）， 或延長反應時間（如：60min 或更長）；則改變后的相應變量需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線的公式：y =8.6631x - 0.0013：x 是 NADPH 摩爾質量（nmol），y 是ΔA。本試劑盒僅供科研使用 3 2、NADP+含量的計算： (1)按樣本鮮重計算： NADP+ (nmol/g 鮮重)=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(W÷2×V 樣÷V3) =11.54×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V1)÷W (2)按細菌或細胞密度計算： NADP+ (nmol/104 cell)=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(500÷2×V 樣÷V3) =0.023×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V1) (3)液體中 NADP+含量計算： NADP+含量(nmol/mL)=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(V 液÷2×V 樣÷V3) =115.43×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V1) 3、NADPH 含量的計算： (1)按樣本鮮重計算： NADPH (nmol/g 鮮重)=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(W÷2×V 樣÷V4) =11.54×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V2)÷W (2)按細菌或細胞密度計算： NADPH (nmol/104 cell)=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(500÷2×V 樣÷V4) =0.023×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V2) (3)液體中 NADPH 含量計算： NADPH 含量(nmol/mL)=[(△A+0.0013)÷8.6631]÷(V 液÷2×V 樣÷V4) =115.43×(ΔA+0.0013) ×(0.5+V2) V 樣---加入反應體系中樣本體積，0.02mL； V 液---所取液體樣本體積：0.1mL； V3---NADP+提取液體積：0.5mL 提取液 A+ V1mL 提取液 B=（0.5+V1）mL； V4---NADPH 提取液體積：0.5mL 提取液 B+ V2mL 提取液 A=（0.5+V2）mL； W---樣本質量，g； 500---細胞或細菌總數(shù)，500 萬； NADPH 分子量---745.4； 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（1μmol/mL）：向標準品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸餾水（NADPH 不 太穩(wěn)定，取出 NADPH 后請盡快使用。如果發(fā)現(xiàn)標準曲線不理想，很有可能是標準 品發(fā)生了降解）。 2 把母液稀釋成五個濃度梯度的標準品：0, 1, 2, 3, 4, 5 nmol/mL。也可根據(jù)實際樣本來 調(diào)整標準品濃度。 3 依據(jù)測定管加樣表操作，根據(jù)結果即可制作標準曲線。