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輔酶Ⅱ  NADP+/NADPH含量試劑盒

輔酶Ⅱ  NADP+/NADPH含量試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 輔酶ⅡNADP+/NADPH 含量試劑盒說(shuō)明書(shū) 【貨號(hào)：WS2080F 分光法 24 樣(可測(cè) 24 個(gè) NADP+，24 個(gè) NADPH）】 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 煙*胺核苷酸的測(cè)定一直是細(xì)胞或組織在能量轉(zhuǎn)化和氧化還原狀態(tài)方面的研究熱點(diǎn)。 NADP+ /NADPH比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一，而且在生物物質(zhì)合成和抗 氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。 本試劑盒提供一種方便，快速的檢測(cè)方法，提供特異性提取液分別提取樣品中的 NADP+ 和 NADPH，NADPH 在遞氫體作用下與一種高靈敏度的顯色劑反應(yīng)生成黃色水溶性甲瓚， 在 450nm 下檢測(cè)，得到 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脫氫酶特異性還原 NADP+為 NADPH，從而檢測(cè) NADP+含量。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 提取液A 液體60mL×1瓶 4℃保存 提取液B 液體60mL×1瓶 4℃保存 試劑一 液體μL×1支 -20℃保存 用前用1.1mL蒸餾水溶解 試劑二 粉劑mg×1支 -20℃保存 用前用1.1mL蒸餾水溶解 試劑三 液體30mL×1瓶 4℃保存 試劑四 EP管1.5mL×1支 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 EP管μg×1支 -20℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 可見(jiàn)分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、 冰和蒸餾水。 四、輔酶ⅡNADP+/NADPH 含量測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 由于 NADP + 和 NADPH 很不穩(wěn)定，較易降解，盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測(cè)。 1、樣本制備（制備完成的 NAD+ / NADH 待測(cè)上清液需盡快檢測(cè)，以免降解）： ① 組織中 NADP +和 NADPH 的提取： NADP +的提取：取約 0.1g 組織（水分充足樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液 A，冰浴研 磨，全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中（用提取液 A 補(bǔ)齊到 1mL），植物樣本于 95℃孵育 5min 或動(dòng)物 樣本于 60℃孵育 30min，取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min；12000rpm 4 ℃離心 10min； 取 500μL 上清液至新 EP 管中，再加 V1 體積的提取液中和（可分次添加提取液 B，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V1）；12000rpm，4℃離心 5min，取上清液置于冰上待測(cè)。 NADPH的提取：取約0.1g組織（水分充足樣本可取0.5g），加入1mL提取液B，冰浴研磨， 全部轉(zhuǎn)移到EP管中（用提取液B補(bǔ)齊到1mL），植物樣本于95℃孵育5min或動(dòng)物樣本于60℃ 孵育30min，取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清 液至新EP管中，再加V2體積的提取液中和（可分次添加提取液A，調(diào)至PH約中性，并記 錄V2）；12000rpm，4 ℃離心5min，取上清液置于冰上待測(cè)。 【注】：若測(cè)出值較低，可加大樣本取樣量，如增加到 0.2g 等，可做幾個(gè)梯度選擇適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。 ② 細(xì)胞或細(xì)菌中 NADP +和 NADPH 的提取： NADP +的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)：取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液 A，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中（用提取液 A 補(bǔ)齊到 1mL），于 60℃孵育 30min，取本試劑盒僅供科研使用 2 出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min；12000rpm 4℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管 中，再加 V1 體積的提取液中和（可分次添加提取液 B，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V1）； 12000rpm，4℃離心 5min，取上清液置于冰上待測(cè)。 NADPH 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)：取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取 液 B，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中（用提取液 B 補(bǔ)齊 1mL），于 60℃孵育 30min，取 出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管 中，再加 V2 體積的提取液中和（可分次添加提取液 A，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V2）； 12000rpm 4 ℃離心 5min，取上清置于冰上待測(cè)。 【注】：若測(cè)出值較低，可加大樣本取樣量，如增至 1000 萬(wàn)等，可做幾個(gè)梯度選適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。 ③ 液體中NADP +和NADPH的提?。?NADP +的提取：取約 0.1mL 液體，加入 1mL 提取液 A，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中 （用提取液 A 補(bǔ)齊到 1.1mL），于 95℃孵育 5min，取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min； 12000rpm 4℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管中，再加 V1 體積的提取液中和（可 分次添加提取液 B，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V1）；12000rpm4℃離心 5min，取上清置冰 上待測(cè)。 NADPH的提取：取約0.1mL液體，加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到EP管中（用 提取液B補(bǔ)齊到1.1mL），于95℃孵育5min，取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清液至新EP管中，再加V2體積的提取液中和（可分次添加提 取液A，調(diào)至PH約中性，并記錄V2）；12000rpm 4 ℃離心5min，取上清液置于冰上待測(cè)。 【注】：若測(cè)出值較低，可加大樣本取樣量，如增至 0.5mL 等，可做幾個(gè)梯度選擇適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。 2、 上機(jī)檢測(cè)： 1 可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，溫度設(shè)定 37℃，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm，蒸餾水調(diào)零。 2 在 1mL 玻璃比色皿中按下表依次加入試劑： 【注】：若ΔA 過(guò)小，可加大樣本取樣質(zhì)量 W；或增加樣本量 V1（由 70 增至 120μL，則試劑三相應(yīng)減少）， 或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（如：60min 或更長(zhǎng)）；則改變后的相應(yīng)變量需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的公式：y =2.9502x - 0.009：x 是 NADPH 摩爾質(zhì)量（nmol），y 是ΔA。 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 樣本 70 試劑一 20 試劑二 20 試劑三 560 37℃避光孵育 10min 試劑四 30 混勻， 37℃條件下，立即在 450nm 處測(cè)定吸光值 A1， 30min 后再測(cè)定 A2，ΔA=A2-A1。本試劑盒僅供科研使用 3 2、NADP+含量的計(jì)算： (1)按樣本鮮重計(jì)算： NADP+ (nmol/g 鮮重)=[(△A+0.009)÷2.9502]÷(W÷2×V 樣÷V3) =9.68×(△A+0.009)×(0.5+V1)÷W (2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： NADP+ (nmol/104 cell)=[(△A+0.009)÷2.9502]÷(500÷2×V 樣÷V3) =0.019×(△A+0.009)×(0.5+V1) (3)液體中 NADP+含量計(jì)算： NADP+含量(nmol/mL)=[(△A+0.009)÷2.9502]÷(V 液÷2×V 樣÷V3) =96.85×(△A +0.009)×(0.5+V1) 3、NADPH 含量的計(jì)算： (1)按樣本鮮重計(jì)算： NADPH (nmol/g 鮮重)=[(△A+0.009)÷2.9502]÷(W÷2×V 樣÷V4) =9.68×(△A+0.009)×(0.5+V2)÷W (2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： NADPH (nmol/104 cell)=[(△A+0.009)÷2.9502]÷(500÷2×V 樣÷V4) =0.019×(△A+0.009)×(0.5+V2) (3)液體中 NADPH 含量計(jì)算： NADPH 含量(nmol/mL)=[(△A+0.009)÷2.9502]÷(V 液÷2×V 樣÷V4) =96.85×(△A+0.009) ×(0.5+V2) V 樣----加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.07mL； V 液----所取液體樣本體積：0.1mL； V3---NADP+提取液體積：0.5mL 提取液 A+ V1mL 提取液 B=（0.5+V1）mL； V4---NADPH 提取液體積：0.5mL 提取液 B+ V2mL 提取液 A=（0.5+V2）mL； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)； NADPH 分子量---745.4； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1μmol/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸餾水（NADPH 不 太穩(wěn)定，取出 NADPH 后請(qǐng)盡快使用。如果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不理想，很有可能是標(biāo)準(zhǔn) 品發(fā)生了降解）。 2 把母液稀釋成五個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 1, 2, 3, 4, 5 nmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái) 調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)測(cè)定管加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。