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輔酶Ⅰ NAD+/NADH含量試劑盒,微板法
輔酶Ⅰ  NAD+/NADH含量試劑盒,微板法
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輔酶Ⅰ NAD+/NADH含量試劑盒,微板法
煙*胺核苷酸的測(cè)定一直是細(xì)胞或組織在能量轉(zhuǎn)化和氧化還原狀態(tài)方面的研究熱點(diǎn)。

輔酶Ⅰ  NAD+/NADH含量試劑盒,微板法

輔酶Ⅰ  NAD+/NADH含量試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 輔酶NAD+ / NADH 含量試劑盒說(shuō)明書(shū) 【貨號(hào):WS1080W 微板法 48 (可測(cè) 48 個(gè) NAD+,48 個(gè) NADH)】 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介 煙*胺核苷酸的測(cè)定一直是細(xì)胞或組織在能量轉(zhuǎn)化和氧化還原狀態(tài)方面的研究熱點(diǎn)。 NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循環(huán)(TCA)的主要?dú)涫荏w,其 NAD+/NADH 比值的 高低不僅可用于評(píng)價(jià)糖酵解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱,而且在生物物質(zhì)合成和抗氧化代謝中具 有重要調(diào)控作用。 本試劑盒提供一種方便,快速的檢測(cè)方法,提供特異性提取液分別提取樣品中的 NAD+ NADHNADH 在遞氫體作用下與一種高靈敏度的顯色劑反應(yīng)生成黃色水溶性甲瓚, 450nm 下檢測(cè),得到 NADH 含量。利用乙醇脫氫酶特異性還原 NAD+NADH,從而 檢測(cè) NAD+含量。 二、試劑盒組成和配制: 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液A 液體120mL×14℃保存 提取液B 液體120mL×14℃保存 試劑一 液體μL×1-20℃保存 用前用1.1mL蒸餾水溶解備用 試劑二 液體μL×1-20℃保存 用前用1.1mL蒸餾水溶解備用 試劑三 液體20mL×14℃保存 試劑四 液體1.1mL×14℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 EP×1-20℃保存 若重新做標(biāo)曲,則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品: 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、輔酶NAD+ / NADH 含量測(cè)定: 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定,了解本批樣品情況,熟悉實(shí)驗(yàn)流程,避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)! 由于 NAD+ NADH 很不穩(wěn)定,較易降解,盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測(cè)。 1、樣本制備(制備完成的 NAD+ / NADH 待測(cè)上清液需盡快檢測(cè),以免降解): 組織中 NAD+NADH 的提取NAD+的提取:取約 0.1g 組織(水分充足樣本可取 0.5g),加入 1mL 提取液 A,冰浴研磨, 全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中(用提取液 A 補(bǔ)齊到 1mL),植物樣本于 95℃孵育 5min 或動(dòng)物樣本 60℃孵育 30min,取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min;12000rpm 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液至新 EP 管中,再加 V1 體積的提取液中和(可分次添加提取液 B,調(diào)至 PH 約中性,并記錄 V1);12000rpm,4℃離心 5min,取上清液置于冰上待測(cè)。 NADH的提取:取約0.1g組織(水分充足樣本可取0.5g),加入1mL提取液B,冰浴研磨, 全部轉(zhuǎn)移到EP管中(用提取液B補(bǔ)齊到1mL),植物樣本于95℃孵育5min或動(dòng)物樣本于60孵育30min,取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min;12000rpm 4 ℃離心10min;取500μL上清 液至新EP管中,再加V2體積的提取液中和(可分次添加提取液A,調(diào)至PH約中性,并記 V2);12000rpm,4 ℃離心5min,取上清液置于冰上待測(cè)。 【注】:若測(cè)出值較低,可加大樣本取樣量,如增加到 0.2g 等,可做幾個(gè)梯度選擇適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。 ② 細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD+NADH 的提取NAD+的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi):取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液 A, 冰浴研磨,全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中(用提取液 A 補(bǔ)齊到 1mL),于 60℃孵育 30min,取出后 立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min;12000rpm 4℃離心 10min;取 500μL 上清液至新 EP 管中,本試劑盒僅供科研使用 2 再加 V1 體積的提取液中和(可分次添加提取液 B,調(diào)至 PH 約中性,并記錄 V1);12000rpm, 4℃離心 5min,取上清液置于冰上待測(cè)。 NADH 的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi):取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液 B,冰浴研磨,全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中(用提取液 B 補(bǔ)齊 1mL),于 60℃孵育 30min,取出 后立即冰浴(或放冰箱)5min;12000rpm 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液至新 EP 管中, 再加 V2 體積的提取液中和(可分次添加提取液 A,調(diào)至 PH 約中性,并記錄 V2);12000rpm 4 ℃離心 5min,取上清置于冰上待測(cè)。 【注】:若測(cè)出值較低,可加大樣本取樣量,如增至 1000 萬(wàn)等,可做幾個(gè)梯度選適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。 ③ 液體中NAD+NADH的提取: NAD+的提取:取約 0.1mL 液體,加入 1mL 提取液 A,冰浴研磨,全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中(用 提取液 A 補(bǔ)齊到 1.1mL),于 95℃孵育 5min,取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min12000rpm 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液至新 EP 管中,再加 V1 體積的提取液中和(可分次添 加提取液 B,調(diào)至 PH 約中性,并記錄 V1);12000rpm,4℃離心 5min,取上清液置于冰 上待測(cè)。 NADH的提取:取約0.1mL液體,加入1mL提取液B,冰浴研磨,全部轉(zhuǎn)移到EP管中(用 提取液B補(bǔ)齊到1.1mL),于95℃孵育5min,取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min12000rpm 4 ℃離心10min;取500μL上清液至新EP管中,再加V2體積的提取液中和(可分次添加提 取液A,調(diào)至PH約中性,并記錄V2);12000rpm 4 ℃離心5min,取上清液置于冰上待測(cè)。 【注】:若測(cè)出值較低,可加大樣本取樣量,如增至 0.5mL 等,可做幾個(gè)梯度選擇適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。 2、 上機(jī)檢測(cè)① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,溫度設(shè)定 37℃,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm。 ② 在 96 孔板中按下表依次加入試劑: 試劑名稱(μL測(cè)定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 150 37℃避光孵育 10min 試劑四 10 混勻, 37℃條件下,立即在 450nm 處測(cè)定吸光值 A130min 后再測(cè)定 A2ΔA=A2-A1。 【注】:若ΔA 過(guò)小,可加大樣本取樣質(zhì)量 W;或增加樣本量 V1(由 20 增至 40μL,則試劑三相應(yīng)減少), 或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間(如:60min 或更長(zhǎng));則改變后的相應(yīng)變量需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算: 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 4.2609x - 0.0071x NADH 摩爾質(zhì)量(nmol),y ΔA。本試劑盒僅供科研使用 3 2NAD+含量的計(jì)算 (1))按樣本鮮重計(jì)算: NAD+ (nmol/g 鮮重)=[(ΔA+0.0071)÷4.2609]÷(W÷2×V ÷V3) =23.47×(ΔA+0.0071)× (0.5+V1)÷W (2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算: NAD+ (nmol/104 cell)=[(ΔA+0.0071)÷4.2609]÷(500÷2×V ÷V3) =0.047×(ΔA+0.0071)× (0.5+V1) (3)液體中 NAD+含量計(jì)算: NAD+含量(nmol/mL)=[(ΔA+0.0071)÷4.2609]÷(V ÷2×V ÷V3) =234.7×(ΔA+0.0071)× (0.5+V1) 3、NADH 含量的計(jì)算: (1)按樣本鮮重計(jì)算: NADH (nmol/g 鮮重)=[(ΔA+0.0071)÷4.2609]÷(W÷2×V ÷V4) =23.47×(ΔA+0.0071)×(0.5+V2)÷W (2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算: NADH (nmol/104 cell)=[(ΔA+0.0071)÷4.2609]÷(500÷2×V ÷V4) =0.047×(ΔA+0.0071)×(0.5+V2) (3)液體中 NADH 含量計(jì)算: NADH 含量(nmol/mL)=[(ΔA+0.0071)÷4.2609]÷(V ÷2×V ÷V4) =234.7×(ΔA+0.0071) ×(0.5+V2) V ---加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL; V ---所取液體樣本體積:0.1mL; V3---NAD+提取液體積:0.5mL 提取液 A+ V1mL 提取液 B=(0.5+V1) mL; V4---NADH 提取液體積:0.5mL 提取液 B+ V2mL 提取液 A=(0.5+V2) mL; W---樣本質(zhì)量,g; 500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn); NADH 分子量---663.4; 附:標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程: 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液(1μmol/mL NADH):向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1.41ml 蒸餾水( NADH 不太穩(wěn)定,取出 NADH 后請(qǐng)盡快使用。如果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不理想,很有可能 是標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)生了降解)。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品:0, 1, 2, 3, 4, 5 nmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái) 調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)加樣表操作,根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。



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