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β-甘露糖苷酶活性檢測試劑盒,微板法

β-甘露糖苷酶活性檢測試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 β-甘露糖苷酶（β-Mannosidase,β-Man）活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS1270W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介 ： β-甘露糖苷酶（EC 3.2.1.25, β-Man）屬于外切水解酶類，又稱 β-D-露糖苷甘露糖水 解酶、外切-β-D-甘露聚糖酶，它能夠催化結(jié)合甘露寡聚糖末端非還原性的 β-1，4-D-糖 苷鍵，并切下一個甘露糖分子，是甘露聚糖*全降解所必需的水解酶。 β-甘露糖苷酶（β-Man）催化對硝基*酚-β-D-吡喃甘露糖苷產(chǎn)生對硝基*酚（PNP）， 該產(chǎn)物在 405nm 處有特征吸收峰，通過測定 405nm 光吸收增加速率，即可計(jì)算β-甘露 糖苷酶活性。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液器、低溫離心機(jī)、天平、研缽、冰和蒸餾水。 四、β-甘露糖苷酶（β-Man）活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本的制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰 浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量(g)：提取液體積(mL)為 1：5~10 比例提取。 ② 細(xì)菌或細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì) 胞，加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個)：提取液體積(mL)為 500~1000：1 的比例提取。 ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長至 405nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 10 10 試劑一 20 試劑二 70 90 迅速混勻，37℃保溫 30min 試劑三 100 100 混勻，5min 后立即于 405nm 下讀取吸光值 A，ΔA=A本試劑盒僅供科研使用 2 測定-A 對照（每個測定管需設(shè)一個對照管）。 【注】：1. 若ΔA 在零附近，可增加樣本加樣體積 V1（即加樣量增加至 40μL，則試劑二相應(yīng)減 少），或延長保溫時間 T（如：由 30min 延長至 60min 或更長），重新調(diào)整的 V1 和 T 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2. 若 A 測定值大于 1.5，可對樣本上清液用蒸餾水稀釋，則稀釋倍數(shù) D 代入公式計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.0427x + 0.003；x 為標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量（nmol），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 對硝基*酚(PNP)為一個酶活單位。 β-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.003) ÷0.0427÷(V1×Cpr)÷T×D =78.06×(ΔA-0.003)÷ Cpr×D 3、按樣本質(zhì)量計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 對硝基*酚(PNP)為一個酶活單位。 β-甘露糖苷酶活性(nmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.003) ÷0.0427÷(V1÷V×W)÷T×D =78.06×(ΔA-0.003)÷W×D 4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 酶活定義：每 104個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 對硝基*酚(PNP)為一酶活單位。 β-甘露糖苷酶活性(nmol/min/104cell)=(ΔA-0.003) ÷0.0427÷(V1÷V×細(xì)胞數(shù)量)÷T×D =78.06×(ΔA-0.003)÷細(xì)胞數(shù)量×D 5、按液體體積計(jì)算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 對硝基*酚(PNP)為一個酶活單位。 β-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mL)=(ΔA-0.003) ÷0.0427÷V1÷T×D =78.06×(ΔA-0.003)×D V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，10μL=0.01mL； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬； T---反應(yīng)時間，30min； D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10μmol/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 在 96 孔板中依次加入：10μL 標(biāo)準(zhǔn)品+90μL 試劑二+100μL 試劑三，混勻于 405nm 下 讀取吸光值，根據(jù)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。