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果膠裂解酶(PL)試劑盒,微板法

果膠裂解酶(PL)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 果膠裂解酶（pectinate lyases，PL）試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS2070W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 果膠裂解酶(反式消去酶，EC 4.2.2.10)是通過反式消去作用裂解果膠聚合體的一種果 膠酶，主要來源于微生物，可提高水果出汁率，并在減少環(huán)境污染等方面具有潛在的應(yīng) 用價(jià)值。 果膠裂解酶（PL）作用于果膠中的α-1,4 糖苷鍵，生成在還原端 C4 和 C5 之間位置具 有不飽和鍵的不飽和寡聚半乳糖醛酸，在 235nm 處有特征吸收峰。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板（UV 板）、天平、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、研缽。 四、果膠裂解酶的測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí) 驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.2g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。 12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌/培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì) 胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間 隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接測(cè)定。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 235nm。 ② 試劑一和試劑二預(yù)先在 50℃水浴 5min。 ③ 在 EP 管中按照下表依次加入試劑： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 試劑一 120 試劑二 120 上清液 20 20 混勻，50℃反應(yīng) 30min 試劑三 60 60 混勻，取 150μL 于 96 孔板（UV 板）測(cè) 定 235nm 處吸光值 A，△A=A 測(cè)定管-A本試劑盒僅供科研使用 2 對(duì)照管（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。 【注】1. 若 A 測(cè)定管大于 2，可減少上清液取樣量 V1（如減至 10μL 則用 10μL 的蒸餾水補(bǔ)齊）， 則改變后的 V1 需代入公式重新計(jì)算。 2. 若△A 在零附近徘徊，可適當(dāng)增加上清液取樣量 V1（如增至 40μL 則試劑三相應(yīng)減少）， 或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如由 30min 延長(zhǎng)至 60min），則改變后的 V1 和 T 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按照蛋白濃度計(jì)算： 酶活性定義：在 50℃，每毫克蛋白每分鐘分解果膠產(chǎn)生 1nmol 不飽和半乳糖醛酸所需的 酶量為一個(gè)酶活力單位。 果膠裂解酶（PL）活性(nmol/min/mg prot)=△A÷(ε×d)×109×V2÷(V1×Cpr)÷T =193.2×△A÷Cpr 2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算： 酶活性定義：在 50℃，每克組織每分鐘分解果膠產(chǎn)生 1nmol 不飽和半乳糖醛酸所需的酶 量為一個(gè)酶活力單位。 果膠裂解酶（PL）活性(nmol/min/g 鮮重)=△A÷(ε×d)×109×V2÷(V1÷V×W)÷T =193.2×△A÷W 3、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算： 單位定義：在 50℃，每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘分解果膠產(chǎn)生 1nmol 不飽和半乳糖醛酸 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。 果膠裂解酶（PL）活性(nmol/min/104 cell)=△A÷(ε×d)×109×V2÷(V1÷V×500)÷T =0.39×△A 4、按液體體積計(jì)算： 酶活性定義：在 50℃，每毫升液體每分鐘分解果膠產(chǎn)生 1nmol 不飽和半乳糖醛酸所需的 酶量為一個(gè)酶活力單位。 果膠裂解酶（PL）活性(nmol/min/mL)=△A÷(ε×d)×109×V2÷V1÷T=193.2×△A ε---不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數(shù)：4600L/mol/cm； d---比色皿光徑，0.375cm； V2---反應(yīng)總體積，2×10-4L； V1---反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL； V---加入提取液體積，1mL； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，30min； 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬； Cpr----樣本蛋白濃度，mg/mL，建議使用本公式的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。