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6-磷酸葡萄糖胺合成酶試劑盒,微板法

6-磷酸葡萄糖胺合成酶試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 6-磷酸葡萄糖胺合成酶試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS8550W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 6-磷酸葡萄糖胺合成酶（GlmS，EC 2.6.1.16）又名 6-磷酸果糖谷*酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)， 是氨基己糖合成代謝途徑中第一步反應(yīng)的催化酶，也是限速酶，該代謝途徑的最終產(chǎn)物鳥苷 氮乙酰葡萄糖胺是生命體糖蛋白的前體和一些真菌細(xì)胞壁主要成分幾丁質(zhì)的合成單體。 6-磷酸葡萄糖胺合成酶（GlmS）催化谷*酰胺和 6-磷酸果糖合成 6-磷酸葡萄糖胺和谷*酸，本試劑盒通過檢測(cè)生成谷*酸的速率進(jìn)而計(jì)算得出該酶活性的大小。 反應(yīng)方程：L-glutamine + D-fructose 6-phosphate = L-glutamate + D-glucosamine 6-phosphate。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 1.2mL 蒸餾水溶解備用 試劑二 液體 25mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 1.2mL 蒸餾水溶解備用 試劑四 液體 1mL×1 支 4℃保存 試劑五 粉體 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 1.1mL 蒸餾水溶解備用 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該標(biāo)曲。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、6-磷酸葡萄糖胺合成酶活性檢測(cè)： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取上 清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)；若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 80 80 試劑一 10本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 110 120 混勻，37℃反應(yīng) 30min（準(zhǔn)確時(shí)間），立即于 95℃沸水中水浴 3 分鐘后， 上下振動(dòng)幾下混勻后，室溫 8000rpm 離心 10min，上清液待測(cè)。 ③ 顯色反應(yīng)：在 96 孔中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 試劑二 70 70 試劑三 10 10 試劑四 10 10 上清液 100 100 試劑五 10 10 混勻，30℃反應(yīng) 30min，于 450nm 處讀取吸光值 A，△A=A 測(cè)定-A 對(duì)照。（若反應(yīng)未終止即吸光值還在上升，須延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間） 【注】若△A 差值在零附近徘徊，可在 37℃反應(yīng)階段延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如增至 1h），或加大加樣體積 V1（如增至 120μL，則試劑二相應(yīng)減少），或增加樣本制備階段取樣質(zhì)量 W（如增加到 0.2g）則 改變后的反應(yīng)時(shí)間 T 或樣本體積 V1 或 W 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = 9.4636x - 0.0018，x 為谷*酸摩爾濃度（μmol/mL），y 為△A。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每小時(shí)生成 1 nmoL 的谷*酸定義為一個(gè)酶活力單位。 GlmS (nmoL/h/mg prot) = [(ΔA+0.0018)÷9.4636] ×V2×103÷(V1×Cpr) ÷T =528.3×(ΔA+0.0018)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 酶活定義：每克組織每小時(shí)生成 1 nmol 的谷*酸定義為一個(gè)酶活力單位。 GlmS（nmoL/h/g 鮮重）=[(ΔA+0.0018)÷9.4636] ×V2×103÷(W×V1÷V) ÷T =528.3×(ΔA+0.0018)÷W 4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 酶活定義：每 104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)生成 1 nmol 的谷*酸 定義為一個(gè)酶活單位。 GlmS (nmoL/h/104 cell)=[(ΔA+0.0018)÷9.4636] ×V2×103÷(500×V1÷V)÷T=1.06×(△A+0.0018) 5、按照液體體積計(jì)算： 酶活定義：每毫升液體每小時(shí)生成 1 nmol 的谷*酸 定義為一個(gè)酶活單位。 GlmS (nmoL/h/mL)= [(ΔA+0.0018)÷9.4636] ×V2×103÷V1÷T=528.3×(ΔA+0.0018) V--提取液體積，1 mL； V1--加入樣本體積，0.08 mL； V2--反應(yīng)總體積，0.2mL； T--反應(yīng)時(shí)間，30min=0.5h； W--樣本質(zhì)量，g； Cpr--樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司 BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10μmol/mL）：標(biāo)準(zhǔn)品用 2mL 的蒸餾水溶解。（母液需在兩天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品：0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1. μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來調(diào)整濃度。 3 依據(jù)顯色反應(yīng)階段，測(cè)定管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。