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海藻糖酶(Trehalase)試劑盒,微板法

海藻糖酶(Trehalase)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 海藻糖酶（Trehalase，THL）試劑盒說明書 （貨號：WS4550W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 海藻糖酶（EC 3.2.1.28）廣泛存在于細(xì)菌、霉菌和動植物中。能夠?qū)Ｒ恍缘乃夂Ｔ逄?生成葡萄糖而直接用于能量供應(yīng)。 海藻糖酶催化海藻糖生成葡萄糖，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下與特異顯色劑反應(yīng) 生成有色物質(zhì)，通過檢測該有色物質(zhì)的生成量，即可得出海藻糖酶的活性大小。 二、測試盒組成和配制： 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、低溫離心機、可調(diào)式移液器、研缽、冰。 四、海藻糖酶(THL)活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g）至研缽中，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰 浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌/真菌樣本： 先收集細(xì)菌或真菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)菌或真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復(fù) 30 次）；4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取 ③ 液體樣本：澄清的液體樣本，可直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 510nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 煮沸樣本：上清液（樣本）在 95-100℃煮沸 5min 即可，然后離心，上清液備用。 ④ 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 100 100（煮沸樣本） 試劑一 200 200 試劑二 50 50 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再 加入 6mL 蒸餾水溶解備用。 試劑三 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再 加入 2.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑四 液體 14mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。本試劑盒僅供科研使用 2 30℃反應(yīng) 1 小時后，8000rpm 離心 10 分鐘，取上清液待測。 ⑤ 顯色反應(yīng)，在 96 孔板中依次加入： 上清液 50 50 試劑三 20 20 試劑四 130 130 40℃反應(yīng) 20min，于 510nm 處讀取吸光值 A， △A=A 測定-A 對照。 【注】1.若測定管 A 值大于 1.5，可以對樣本用蒸餾水進(jìn)行稀釋（尤其是含糖量高的果實類樣本）， 或者對⑤步的上清液用蒸餾水進(jìn)行稀釋，則稀釋倍數(shù) D 代入計算公式計算。 2.若△A 差值在零附近，可增加④步中樣本的體積 V1（如增至 200μL，則試劑一相應(yīng)減少）， 則改變后的 V1 需代入公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = 0.106x + 0.0011；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 為△A。 2、按照蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白在每小時催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。 THL (μg/h/mg prot)=[(ΔA-0.0011)÷0.106×(0.35÷0.05)]÷(V1×Cpr)÷T=660.4×(ΔA-0.0011)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織每小時催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。 THL (μg/h/g 鮮重)=[(ΔA-0.0011)÷0.106×(0.35÷0.05)]÷(W×V1÷V)÷T=660.4×(ΔA-0.0011)÷W 4、按細(xì)菌或真菌密度計算： 酶活定義：每 1 萬個細(xì)菌或真菌每小時催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。 THL (μg/h/104cell)=[(ΔA-0.0011)÷0.106×(0.35÷0.05)]÷(500×V1÷V)÷T=1.321×(ΔA-0.0011) 5、按液體體積計算： 酶活定義：每毫升液體每小時催化產(chǎn)生 1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。 THL (μg/h/mL)= [(ΔA-0.0011)÷0.106×(0.35÷0.05)]÷V1÷T=660.4×(ΔA-0.0011) V--提取液體積，1 mL；V1--樣本體積：0.1mL；W--樣本質(zhì)量，g；T--反應(yīng)時間，1 小時； 500--細(xì)菌或真菌數(shù)量，500 萬；0.35--第④歩反應(yīng)的總體積；0.05--第⑤歩反應(yīng)上清液體積； Cpr--樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：從標(biāo)準(zhǔn)品管中稱量取出 2mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸餾水混勻溶解即 1mg/mL 的葡萄糖（母液需在兩天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成以下濃度：0, 0.04,0.08,0.12,0.16, 0.2mg/mL。 3 于第⑤歩顯色反應(yīng)階段：50μL 標(biāo)準(zhǔn)品+20μL 試劑三+130μL 試劑四，40℃反應(yīng) 20min， 于 510nm 處讀取吸光值 A，依據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。