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結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)試劑盒微板法

結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase，GBSS）試劑盒 （貨號：WS8350W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 結(jié)合態(tài)淀粉合成酶 GBSS（EC 2.4.1.21）以束縛態(tài)存在于淀粉體中，催化淀粉鏈的加長反應(yīng)，主要負責(zé) 直鏈淀粉的合成。GBSS 催化 ADPG 與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng)，將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上，同時生 成 ADP，通過反應(yīng)體系中添加的酶促混合物依次催化 NADP+還原為 NADPH，且 NADPH 生成量與前一 步反應(yīng)中 ADP 生成量呈正比。 傳統(tǒng)方法是通過檢測 340nm 下 NADPH 增加量，但該法檢測靈敏度低，且易受到色素（如綠色葉片） 干擾，本試劑盒提供一種簡單，靈敏，快速的測定方法：該酶促過程產(chǎn)生的 NADPH 與特異的顯色探針反 應(yīng)生成有色物質(zhì)，通過在 450nm 下檢測該有色物質(zhì)的增加速率，進而計算出 GBSS 酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×2 瓶 4℃保存 試劑一 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 6.5 mL×1 瓶 4℃保存 呈分散狀態(tài)，用前務(wù)必搖勻，即可使用。 試劑三 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部，再加 1.1 mL 的蒸餾水溶解備用。 試劑四 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部，再加 6.5 mL 的試劑一溶解備用。 試劑五 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部，再加 17.5 mL 的試劑一溶解備用。 試劑六 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部，再加 2.2mL 蒸餾水溶解備用。 試劑七 液體 2.2mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、結(jié)合態(tài)淀粉合成酶（GBSS）活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： 稱取約 0.1g 組織（水分多的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。 12000rpm，4℃離心 10min，棄上清，在沉淀中加入 1mL 提取液充分混勻，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 2、上機檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，設(shè)定溫度 25℃，調(diào)節(jié)波長至 450nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本（懸浮液） 40 40 試劑一 140 150 試劑二（用前務(wù)必搖勻） 30 30 試劑三 10 試劑四 30 30 混勻，30℃反應(yīng) 20min，沸水浴(95-100℃)2min，12000rpm，本試劑盒僅供科研使用 1 4℃離心 10min，上清液待測。 ③ 顯色反應(yīng)，在 96 孔板中依次加入： 【注】：1.若ΔA 過小，可加大樣本量 V1（如：增至 80μL，則試劑一相應(yīng)減少，反應(yīng)總體積不變）； 或延長②步中 30℃的反應(yīng)時間 T（如：延至 30min 或更長）；或增加樣本取樣質(zhì)量 W；則 調(diào)整后的 V1 和 T 和 W 需代入計算公式重新計算。 2. 若 A 測定大于 1，則可在③步中對上清液用蒸餾水進行稀釋，稀釋倍數(shù) D 代入公式計算。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.1132x + 0.0032，x 是 NADPH 摩爾質(zhì)量：nmol，y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。 GBSS (nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0032)÷0.1132×(V3÷V2)]÷(Cpr×V1) ÷T×D =27.6×(ΔA-0.0032)÷Cpr×D 3、按照樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。 GBSS(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0032)÷0.1132×(V3÷V2)]÷(W×V1÷V)÷T×D =27.6×(ΔA-0.0032)÷W×D V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.04mL； V2---上清液體積，100μL； V3---反應(yīng)體系總體積，250μL； T---反應(yīng)時間，20min； W---樣本質(zhì)量； D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1nmol/μL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸餾水（母液需在兩 天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根據(jù)實際 樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 10μL 的標(biāo)準(zhǔn)品+180μL 蒸餾水+10μL 試劑七，混勻 10min 后，于 450nm 處讀取吸光 值，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 上清液 100 100 試劑五 80 80 試劑六 10 10 試劑七 10 10 混勻，室溫（25℃）孵育 15min，立即于 450nm 處讀取吸光 值。△A=A 測定-A 對照（每個樣本需做一個樣本自身對照）。