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結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)試劑盒微板法
結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)試劑盒微板法
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【簡(jiǎn)單介紹】
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結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)試劑盒微板法
結(jié)合態(tài)淀粉合成酶 GBSS(EC 2.4.1.21)以束縛態(tài)存在于淀粉體中,催化淀粉鏈的加長(zhǎng)反應(yīng),主要負(fù)責(zé) 直鏈淀粉的合成。

結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)試劑盒微板法

結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase,GBSS)試劑盒 (貨號(hào):WS8350W 微板法 96 樣) 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介: 結(jié)合態(tài)淀粉合成酶 GBSSEC 2.4.1.21以束縛態(tài)存在于淀粉體中,催化淀粉鏈的加長(zhǎng)反應(yīng),主要負(fù)責(zé) 直鏈淀粉的合成。GBSS 催化 ADPG 與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng),將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上,同時(shí)生 ADP,通過(guò)反應(yīng)體系中添加的酶促混合物依次催化 NADP+還原為 NADPH,且 NADPH 生成量與前一 步反應(yīng)中 ADP 生成量呈正比。 傳統(tǒng)方法是通過(guò)檢測(cè) 340nm NADPH 增加量,但該法檢測(cè)靈敏度低,且易受到色素(如綠色葉片) 干擾,本試劑盒提供一種簡(jiǎn)單,靈敏,快速的測(cè)定方法:該酶促過(guò)程產(chǎn)生的 NADPH 與特異的顯色探針?lè)?應(yīng)生成有色物質(zhì),通過(guò)在 450nm 下檢測(cè)該有色物質(zhì)的增加速率,進(jìn)而計(jì)算出 GBSS 酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制: 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×2 4℃保存 試劑一 液體 60mL×1 4℃保存 試劑二 液體 6.5 mL×1 4℃保存 呈分散狀態(tài),用前務(wù)必?fù)u勻,即可使用。 試劑三 粉體 mg×1 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部,再加 1.1 mL 的蒸餾水溶解備用。 試劑四 粉體 mg×1 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部,再加 6.5 mL 的試劑一溶解備用。 試劑五 粉體 mg×1 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部,再加 17.5 mL 的試劑一溶解備用。 試劑六 粉體 mg×1 4℃保存 臨用前甩幾下使試劑落入底部,再加 2.2mL 蒸餾水溶解備用。 試劑七 液體 2.2mL×1 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 -20℃保存 若重新做標(biāo)曲,則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品: 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)活性檢測(cè): 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定,了解本批樣品情況,熟悉實(shí)驗(yàn)流程,避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)! 1樣本制備: 稱(chēng)取約 0.1g 組織(水分多的樣本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,進(jìn)行冰浴勻漿。 12000rpm,4℃離心 10min,棄上清,在沉淀中加入 1mL 提取液充分混勻,置冰上待測(cè)。 【注】:若增加樣本量,可按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10 的比例提取 2、上機(jī)檢測(cè): ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,設(shè)定溫度 25℃,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm② 所有試劑解凍至室溫(25℃),在 EP 管中依次加入: 試劑名稱(chēng)(μL測(cè)定管 對(duì)照管 樣本(懸浮液) 40 40 試劑一 140 150 試劑二(用前務(wù)必?fù)u勻) 30 30 試劑三 10 試劑四 30 30 混勻,30℃反應(yīng) 20min,沸水浴(95-100℃)2min12000rpm,本試劑盒僅供科研使用 1 4℃離心 10min,上清液待測(cè)。 ③ 顯色反應(yīng),在 96 孔板中依次加入: 【注】:1.ΔA 過(guò)小,可加大樣本量 V1(如:增至 80μL,則試劑一相應(yīng)減少,反應(yīng)總體積不變); 或延長(zhǎng)步中 30℃的反應(yīng)時(shí)間 T(如:延至 30min 或更長(zhǎng));或增加樣本取樣質(zhì)量 W;則 調(diào)整后的 V1 T W 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2. A 測(cè)定大于 1,則可在步中對(duì)上清液用蒸餾水進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尡稊?shù) D 代入公式計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算: 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y = 0.1132x + 0.0032x NADPH 摩爾質(zhì)量:nmol,y ΔA2、按樣本蛋白濃度計(jì)算: 酶活定義:每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 GBSS (nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0032)÷0.1132×(V3÷V2)]÷(Cpr×V1) ÷T×D =27.6×(ΔA-0.0032)÷Cpr×D 3、按照樣本鮮重計(jì)算: 酶活定義:每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 GBSS(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0032)÷0.1132×(V3÷V2)]÷(W×V1÷V)÷T×D =27.6×(ΔA-0.0032)÷W×D V---加入提取液體積,1mL; V1---加入樣本體積,0.04mL; V2---上清液體積,100μL; V3---反應(yīng)體系總體積,250μL; T---反應(yīng)時(shí)間,20min; W---樣本質(zhì)量; D---稀釋倍數(shù),未稀釋即為 1; Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附:標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程: 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液(1nmol/μL):向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸餾水(母液需在兩 天內(nèi)用且-20℃保存)。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 10μL 的標(biāo)準(zhǔn)品+180μL 蒸餾水+10μL 試劑七,混勻 10min 后,于 450nm 處讀取吸光 值,根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 上清液 100 100 試劑五 80 80 試劑六 10 10 試劑七 10 10 混勻,室溫(25℃)孵育 15min,立即于 450nm 處讀取吸光 值。A=A 測(cè)定-A 對(duì)照(每個(gè)樣本需做一個(gè)樣本自身對(duì)照)。



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