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可溶性糖含量(SS)試劑盒,微板法

可溶性糖含量(SS)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 可溶性糖含量試劑盒說明書 (貨號：WS1050W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 糖類物質是構成植物體的重要組成成分之一，也是新陳代謝的主要原料和貯存物質。 糖類在濃硫酸作用下經脫水反應生成糠醛或羥甲基糖醛，生成的糠醛或羥甲基糖醛與蒽酮 脫水縮合，形成糠醛的衍生物，呈藍綠色物質，其在可見光區(qū) 620nm 波長處有吸收， 且其光吸收值在一定范圍內與糖的含量成正比關系。該方法用于可溶性單糖、寡糖和多糖 的含量測定，具有靈敏度高﹑簡便快捷﹑適用于微量樣品的測定等優(yōu)點。 該方法的特點是幾乎可以測定所有的糖類（包括單糖：戊糖、已糖、蔗糖、糖原、多 縮葡萄糖等），所以用該方法測出的糖類含量是溶液中全部可溶性糖類含量。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 試劑一 粉劑×2 支 4℃避光保存 試劑二 液體 5mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 工作液配制：吸取 2mL 試劑二加入到一支試劑一中，混勻并充分溶解，即得工作液。 （如難溶解，可超聲溶解或者 60℃水浴溶解；剩余試劑 4℃保存一周）。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、可調式移液器、乙醇、濃硫酸（不允許快遞）、研缽。 四、可溶性糖含量的測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 建議：選取樣本做幾個梯度的稀釋，選取適合本次實驗的稀釋倍數 D。 ① 組織樣本： 稱取 0.1g 樣本（若是干樣，如烘干煙葉等可取 0.05g；若是水分充足的樣本可取 0.2g）， 先加入 0.8mL 的 80%乙醇（自備：取 80mL 乙醇溶于 20mL 蒸餾水中），冰浴勻漿，倒 入有蓋離心管中，再用 80%乙醇沖洗研缽并轉移至同一 EP 管中，使 EP 管中粗提液終體 積定容為 1.5mL（若用自動研磨機可直接加入 1.5mL 的 80%乙醇研磨）；置 50℃水浴 20min（封口膜纏緊，防止液體散失，且間隔 2min 振蕩混勻一次），冷卻后（若有損失， 可加 80%乙醇補齊至 1.5mL），12000rpm，室溫離心 10min，取上清液備用。 【注】:若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。 ② 細菌/細胞樣本：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細 胞至 EP 管中，加入 1.5mL 的 80%乙醇（自備：取 80mL 乙醇溶于 20mL 蒸餾水中）超 聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；置 50℃ 水浴 20min（封口膜纏緊，防止液體散失，且間隔 2min 振蕩混勻一次），冷卻后（若 有損失，可加 80%乙醇補齊至 1.5mL），12000rpm，室溫離心 10min，取上清液備用。 【注】:若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本： 澄清的液體樣本直接檢測，若渾濁則需 12000rpm，室溫離心 10min，取上清液備用。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 620nm。本試劑盒僅供科研使用 2 ② 調節(jié)水浴鍋至 95-100℃，工作液用前需*全溶解。 ③ 提示：大多數樣本可溶性糖含量較高，為使ΔA 值在 1 以內，實驗前可選取幾個樣本 做預測定，用蒸餾水把上清液稀釋成不同濃度，找出適合本次檢測樣本的稀釋倍數 D。 （強調：嚴禁稀釋加熱反應后的混合液，否則會出現渾濁現象）。 ④ 在 EP 管中依次加入： 試劑（μL） 測定管 空白管（僅做一次） 樣本 25 0 蒸餾水 75 100 工作液 30 30 濃硫酸(緩慢加入) 250 250 混勻后，放入 95-100℃水浴中 10min（封口膜纏緊，防止 水分散失），冷卻至室溫后，取 200μL 轉移至 96 孔板中， 于 620nm 讀取吸光值 A，ΔA=A 測定管-A 空白管。 【注】 若ΔA 的值接近零，可增加樣本加樣體積 V1（如由 25μL 增至 50μL， 則蒸餾水相應減少），則改變后的 V1 代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準方程為 y = 2.0899x - 0.0103；x 為標準品濃度（mg/mL），y 為吸光值ΔA。 2、按樣本重量計算： 可溶性糖(mg /g 重量)=[(ΔA+0.0103)÷2.0899×V1]÷(W×V1÷V) ×D =0.718×(ΔA+0.0103)÷W×D 3、按質量分數（%）計算： 可溶性糖(%重量)=[(ΔA+0.0103)÷2.0899×V1]÷(W×V1÷V) ×10-3× =[0.0718×(ΔA+0.0103)÷W×D]% 4、按細菌/細胞數量計算： 可溶性糖(mg /104cell)=[(△A+0.0103)÷2.0899×V1]÷(500×V1÷V)×D =0.00144×(ΔA+0.0103)×D 5、按液體體積計算： 可溶性糖(mg/mL)=(ΔA+0.0103)÷2.0899×D=0.479×(ΔA+0.0103)×D V---樣品提取液總體積，1.5mL； V1---測定時所取樣本的體積，0.025mL； W---樣本質量，g； 500---細胞數量，萬； D---自行稀釋倍數，未稀釋即為 1。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（1mg/mL）：從標準品管中稱量取出 2mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸餾水混勻溶解即 1mg/mL 的標準品（母液需在兩天內用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5. mg/mL。 3 依據測定管的加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。