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支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT)測定試劑盒微板法

支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT)測定試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(Branched-chain amino acid aminotransferase，BCAT) 試劑盒說明書 （貨號：WS3440W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT, E.C.2.6.1.42) 屬于以磷酸吡哆醛作為輔酶的Ⅳ類轉(zhuǎn)氨酶。該酶分布十分廣 泛，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)廣泛存在于原核生物和大多數(shù)真核生物中。 支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT)催化特異 L-型氨基酸氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸，形成相應(yīng)的支鏈α-酮酸和谷*酸； 再用特異作用于谷*酸的酶復(fù)合體分解谷*酸，同時與顯色劑反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，該物質(zhì)在 450nm 處 有吸收峰，進(jìn)而得到支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT)的酶活性大小。 該酶催化反應(yīng)：L-leucine + 2-oxoglutarate = 4-methyl-2-oxopentanoate + L-glutamate。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試管底部， 再加 2.2mL 的蒸餾水充分溶解，仍 4℃保存。 試劑二 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試管底部， 再加 1.2mL 蒸餾水溶解備用。仍 4℃保存。 試劑三 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試管底部， 再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。仍 4℃保存。 試劑四 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 2mL×1 支 4℃保存 試劑六 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試管底部， 再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。仍-20℃保存。 試劑七 液體 1mL×1 支 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 液體 mL×1 支 4℃保存 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT)酶活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織（水分多的樣本取 0.5g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴 勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】:若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液； 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，300W，超聲 3s，間隔 7s，總時間 3min）；12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】:若增加樣本量，按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(104個) :提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 450nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 試劑一 20 20本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 20 試劑三 10 10 試劑四 150 170 樣本 100 100 混勻，37℃反應(yīng) 60min（準(zhǔn)確時間），立即于 95℃沸水中水浴 2min 后， 上下振動幾下混勻后，12000rpm 室溫離心 5 分鐘，上清液待測。 ③ 顯色反應(yīng)：在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 提取液 100 100 試劑五 20 20 試劑六 10 10 試劑七 10 10 上清液 60 60 混勻，30℃反應(yīng) 15min，立即于 450nm 處讀取吸光值 A，△A=A 測定-A 對照。（每個樣本需設(shè)一個自身對照 ） 【注】若△A 差值在零附近徘徊，可以在顯色反應(yīng)階段增加上清液（V3）的量（如增加到 120μL）， 則提取液相應(yīng)減少，改變后的 V3 重新代入公式計算；或延長第②歩中 30℃反應(yīng)時間 T（如由 60min 增加至 90min），則改變后的反應(yīng)時間 T 需代入計算公式重新計算。。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = 0.106x - 0.0032，x 為谷*酸摩爾質(zhì)量（nmol），y 為△A。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每小時生成 1 nmol 的谷*酸定義為一個酶活力單位。 BCAT (nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0032)÷0.106] ×(V2÷V3)÷(V1×Cpr) ÷T =471.7×(ΔA+0.0032)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每小時生成 1 nmol 的谷*酸定義為一個酶活力單位。 BCAT (nmol/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0032)÷0.106] ×(V2÷V3)÷(W×V1÷V) ÷T =471.7×(ΔA+0.0032)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算： 單位定義：每百萬細(xì)菌或細(xì)胞每小時生成 1 nmol 的谷*酸定義為一個酶活力單位。 BCAT (nmol/h/104 cell)=[(ΔA+0.0032)÷0.106] ×(V2÷V3)÷(500×V1÷V) ÷T=0.94×(ΔA+0.0032) V---提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.1 mL； V2---反應(yīng)總體積，0.3mL； V3---顯色階段上清液體積，0.06mL； T---反應(yīng)時間，60min=1h； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞數(shù)量，百萬；Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司 BCA 蛋白含量測定試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 標(biāo)準(zhǔn)品母液（10nmol/μL）。 2 把母液稀釋成六個梯度：0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1. nmol/μL。也可根據(jù)實際樣本來調(diào)整濃度。 3 依據(jù)顯色反應(yīng)階段，測定管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。