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乙酰乳酸合成酶（ALS）活性試劑盒,微板法

乙酰乳酸合成酶（ALS）活性試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase, ALS）活性測(cè)定試劑盒 （貨號(hào)：WS2440W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 乙酰乳酸合成酶( ALS，EC 2.2.1.6) 是支鏈氨基酸生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，此生 物合成過程只存在于植物和微生物體內(nèi)，是綠色除草劑的重要作用靶標(biāo)。 乙酰乳酸合成酶( ALS)可催化 2 分子的丙酮酸生成乙酰乳酸，該產(chǎn)物在硫酸作用下脫羧 生成乙酰甲基甲醇，該產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)，該有色物質(zhì)在 525nm 處有特征 吸收峰，通過檢測(cè)該有色物質(zhì)的增加速率即可得出 ALS 酶活性大小。 反應(yīng)方程式：2 pyruvate =2-acetolactate+CO2。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底 部，再加 1.2mL 蒸餾水混勻 溶解，仍 4℃保存。 試劑二 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 2mL×1 支 4℃保存 試劑四 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、蒸餾水。 四、乙酰乳酸合成酶（ALS）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰 浴勻漿，4℃×12000rpm 離心 15min，取上清液待測(cè)。 【注】:若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：先收集細(xì)菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加 入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重 復(fù) 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)為 525nm。 ② 所有試劑于 25℃水浴中預(yù)熱 10 min。 ③ 在 EP 管中依次加入下列試劑： 試劑名稱（μL） 樣本管 對(duì)照管 試劑一 20 試劑二 130 150本試劑盒僅供科研使用 2 樣本 50 50 35℃條件下，暗反應(yīng) 1h 試劑三 20 20 60℃條件下水浴脫羧 15min 試劑四 100 100 試劑五 100 100 60℃條件下水浴顯色 15min，12000rpm 離心 5min， 取 200μL 澄清液體至 96 孔板中，于 525nm 處讀值。 ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。 【注】：若ΔA 的值非常低在零附近，可增加樣本量 V1（如增至 100μL，則試劑二相應(yīng)減少） 或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如增至 2h 或更長(zhǎng)），則重新調(diào)整的 V1 和 T 代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0217x - 0.0003，x 是標(biāo)準(zhǔn)品乙酰甲基甲醇摩爾質(zhì)量（nmol）；y 是△A。 2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算： 酶活定義：每克組織每小時(shí)催化底物產(chǎn)生 1nmol 乙酰甲基甲醇定義為一個(gè)酶活單位。 ALS (nmol/h/g 鮮重)=[(△A+0.0003)÷0.0217]÷(W×V1÷V)÷T×D=921.7×(△A+0.0003)÷W×D 3、按照樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克蛋白每小時(shí)催化底物產(chǎn)生 1nmol 乙酰甲基甲醇定義為一個(gè)酶活單位。 ALS (nmol/h/mg prot)=[(△A+0.0003)÷0.0217]÷(Cpr×V1)÷T×D=921.7×(△A+0.0003)÷Cpr×D 4、按細(xì)菌數(shù)量計(jì)算： 酶活定義：每 104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)催化底物產(chǎn)生 1nmol 乙酰甲基甲醇定義為一個(gè)酶活單位。 ALS (nmol/h/104 cell)=[(△A+0.0003)÷0.0217]÷(500×V1÷V)÷T×D=1.84×(ΔA+0.0003)×D W---樣品質(zhì)量，g； V---提取液體積，1 mL； V1---上清液體積（mL），0.05mL； T---反應(yīng)時(shí)間，1h。 D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； 500---細(xì)胞數(shù)量，萬； Cpr---上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水混勻溶解。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL。也 可根據(jù)實(shí)際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)對(duì)照管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品乙酰甲基甲醇的摩 爾質(zhì)量為 88.11。