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土壤天冬酰胺酶（S-ASNase）試劑盒,微板法

土壤天冬酰胺酶（S-ASNase）試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 土壤天冬酰胺酶(solid-asparaginase,S-ASNase) 測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS6430W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 天冬酰胺酶（ASNase，EC 3.5.1.1）是酰胺酶的一種，催化天冬酰胺水解成天冬氨酸 和氨，在氮素代謝中具有重要調(diào)控作用。 土壤中的天冬酰胺酶（S-ASNase）催化天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨，利用氨在強(qiáng)堿 的環(huán)境下與次氯酸鹽和*酚作用，生成水溶性染料靛酚藍(lán)，溶液顏色穩(wěn)定。其在 630nm 處有特征吸收峰，通過(guò)檢測(cè)氨增加的速率，即可計(jì)算該酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 試劑一 液體 40mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部， 每瓶再加 11mL 蒸餾水溶解備用。 試劑三 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 A：液體 3.5mL×4 瓶 B：液體μL×1 支 4℃保存 臨用前取 30μL 的 B 液進(jìn)一瓶 A 液中，混勻后作為試劑六使用。 混勻后的試劑六一周內(nèi)用完。 標(biāo)準(zhǔn)管 液體 mL×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該標(biāo)曲。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱、甲苯和蒸餾水。 四、土壤天冬酰胺酶（S-ASNase）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本的制備： 取新鮮土樣風(fēng)干或者 37℃烘箱風(fēng)干，先粗研磨，過(guò) 40 目篩網(wǎng)，備用。 【注】：土壤風(fēng)干，減少土壤中水分對(duì)于實(shí)驗(yàn)的干擾；土壤過(guò)篩，保證取樣的均勻細(xì)膩； 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 培養(yǎng)：取 EP 管依次加入： 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 土樣（g） 0.1 0.1 甲苯 20 20 振蕩混勻，室溫放置 15min 試劑一 200 200 試劑二 100 混勻，放入 37℃水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱中孵育 2h 試劑三 300 300 試劑二 100 充分混勻，沸水?。?/span>95℃-100℃）10min，室溫 12000rpm 離心 10min， 上清液待測(cè)。本試劑盒僅供科研使用 2 ② 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 630nm。 ③ 顯色反應(yīng)：在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 上清液 15 15 蒸餾水 45 45 試劑四 60 60 試劑五 30 30 試劑六 60 60 充分混勻，37℃放置 20min 后，于 630nm 處讀取吸光值 A， ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。 【注】1. 試劑四和五和六需分開(kāi)加，不能事先混勻。 2. 若ΔA 的值較小，可以增加 37℃孵育時(shí)間 T（如增至 4 小時(shí)或更長(zhǎng)），或在顯色反應(yīng)階段增加上 清液的量 V1(如增至 30μL，則蒸餾水體積相應(yīng)減少)；則改變后的反應(yīng)時(shí)間 T 和上清液體積 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 3. 若 A 測(cè)定的值大于 1.5，可以減少 37℃孵育時(shí)間 T（如減至 1 小時(shí)或更短），或在顯色反應(yīng)階段 減少上清液的量 V1(如減至 5μL，則蒸餾水體積相應(yīng)增加)；則改變后的反應(yīng)時(shí)間 T 和上清液體 積 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為 y = 3.1715x - 0.0164；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 為吸光值ΔA。 2、單位定義：每克土樣每小時(shí)催化天冬酰胺生成 1μg 氨定義為一個(gè)酶活力單位。 S-ASNase (μg/h/g 土樣)=(ΔA+0.0164) ÷3.1715×(V÷V1)÷W÷T =6.52×(ΔA+0.0164) ÷W V---反應(yīng)體系總體積，0.62mL； V1---顯色反應(yīng)階段上清液體積，0.015mL； T---反應(yīng)時(shí)間，2h； W---土樣質(zhì)量； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作過(guò)程： 1 標(biāo)準(zhǔn)品母液（20μg/mL 的氨）： 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 4, 8, 12, 16, 20 μg/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本 來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 按照顯色反應(yīng)階段的測(cè)定管加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。