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NADH-谷an酸脫氫酶(NADH-GDH)試劑盒微板法

NADH-谷an酸脫氫酶(NADH-GDH)試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 NADH-谷*酸脫氫酶（NADH-GDH）試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS5040W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 谷*酸脫氫酶廣泛分布于生物體中，在氨同化和轉(zhuǎn)化成有機(jī)氮化合物的代謝中起重要作 用。其輔酶是 NADH 或 NADPH，在動(dòng)植物種兩種輔酶都有存在，而以 NADH-谷*酸脫 氫酶（EC 1.4.1.2）活力為主。 本試劑盒提供一種快速靈敏的檢測(cè)方法，樣品中的 NADH-谷*酸脫氫酶特異性作用于底 物谷*酸并產(chǎn)生 NADH，同時(shí)與顯色劑反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，該物質(zhì)在 450nm 處有吸收 峰，進(jìn)而得到 NADH-GDH 的酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、NADH-谷*酸脫氫酶（NADH-GDH）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取 液；超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn) 行提取 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 450nm。 ② 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 110mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 5mL×1 瓶 4℃保存 濃度為 1M 試劑二 液體 2mL×1 支 4℃保存 試劑三 液體 1mL×1 支 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 提取液 80 試劑一 50 試劑二 20 樣本 40 試劑三 10 混勻，立即 450nm 下讀取 A1 值，15min本試劑盒僅供科研使用 2 【注】：若ΔA 值過小，可以延長反應(yīng)時(shí)間 T（如由 15min 增至 30min 或 1 小時(shí)）， 或增加加樣體積 V1（如由 40μL 增至 80μL，則提取液相應(yīng)減少），則改變 后的 T 和 V1 需要代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程：y = 0.0614x - 0.0064，x 是 NADH 摩爾質(zhì)量（nmol），y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NADH-GDH(nmol/min /mg prot)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(V1×Cpr) ÷T =27.14×(ΔA+0.0064)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NADH-GDH(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(W×V1÷V) ÷T =27.14×(ΔA+0.0064)÷W 4、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算： 單位定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NADH-GDH(nmol/min /104 cell)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷(500×V1÷V) ÷T =0.0543×(ΔA+0.0064) 5、按液體體積計(jì)算： 單位定義：每毫升液體每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NADH-GDH(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0064)÷0.0614]÷V1÷T=27.14×(ΔA+0.0064) V---加入提取液體積，1 mL；V1---加入樣本體積，0.04 mL； T---反應(yīng)時(shí)間，15min； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1nmol/μL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1.41ml 蒸餾水（母液需在兩 天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2. nmol /μL。也可根 據(jù)實(shí)際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)測(cè)定管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 后讀取 A2 值。ΔA=A 2-A1。