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△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)試劑盒

△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）試劑盒說明書 （貨號：WS4011F 紫外分光法 24 樣） 一、產(chǎn)品簡介： Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是植物體內(nèi)脯*酸生物合成的關(guān)鍵酶，同時也是植 物在遭受脅迫時脯*酸合成的限速酶；脯*酸作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，與植物對干旱和 鹽脅迫的適應(yīng)性密切相關(guān)。所以 P5CS 在調(diào)節(jié)脯*酸的代謝水平上具有重要作用。 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）催化谷*酸轉(zhuǎn)化成γ-谷*酸半醛，同時使 NADPH 氧化成 NADP+，通過檢測 NADPH 在 340nm 處的下降速率，即可得出 P5CS 酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 粉體 mg×2 支 -20℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 每支分別加入 0.6mL 蒸餾水溶解備 用，用不完的試劑分裝后-20℃保 存，禁止反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 試劑三 液體 26mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉體 mg×2 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 紫外分光光度計、1mL 石英比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、離心機、可調(diào)式移液器、 研缽、冰和蒸餾水。 四、Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣本情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、 樣本制備： 1 組織樣本： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清 液待用。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接檢測，若渾濁則離心后取上清檢測。 2、 上機檢測： ① 紫外分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。 2 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 3 制備對照管樣本：取出同一個樣本的部分上清液至一新 EP 管中，于 95℃水浴中煮沸 10min 后取出，冷卻至室溫后于 12000rpm，4℃或者室溫離心 10min，取離心后的上 清液作為該樣本的對照管樣本備用。本試劑盒僅供科研使用 2 4 在 1mL 石英比色皿（光徑 1cm）中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 120 120（煮沸的樣本） 試劑一 20 20 試劑二 20 20 試劑三 520 520 試劑四 20 20 混勻，室溫（25℃）下，30s 時立即于 340nm 處分別讀取吸光 值 A1，10min 后讀取 A2，△A=（A1-A2）測定-（A1-A2）對 照（每個樣本需做一個自身對照）。 【注】1.若ΔA 的值在零附近徘徊，則可延長反應(yīng)時間 T（如增至 30min 或更長），或加大樣本 量 V1（如增至 180μL，則試劑三相應(yīng)減少），則改變后的反應(yīng)（孵育）時間 T 或加 樣體 積 V1 需代入計算公式重新計算。 2.若起始值 A1 太大如超過 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對 會偏高），可以適當(dāng)減少樣本加樣量（則試劑三相應(yīng)增加），則改變后的加樣體積需代 入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白在每分鐘內(nèi)氧化 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。 P5CS 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=93.8×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織在每分鐘內(nèi)氧化 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。 P5CS 活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V) ÷T=93.8×ΔA÷W 3、按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計算： 單位定義：每 104個細(xì)胞在每分鐘內(nèi)氧化 1nmol NADPH 定義為一個酶活單位（U）。 P5CS 活性(nmoL/min /104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.188×△A 4、液體中 P5CS 活力的計算： 單位定義：每毫升液體在每分鐘內(nèi)氧化 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。 P5CS 活性(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T=93.8×ΔA V---提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.12mL； V2---反應(yīng)體系總體積：7×10-4 L； d---光徑，1cm； T---反應(yīng)時間，10min； W---樣本質(zhì)量，g； ε---NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。