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木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lip)試劑盒,微板法

木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lip)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lignin peroxidase，Lip）試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS5001W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（EC1.11.1.14）是一種含亞鐵血紅素的過(guò)氧化物酶，屬于木質(zhì)素降解 酶系，在木質(zhì)素生物降解、造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、芳香化合物轉(zhuǎn)化與降解及環(huán)境污染控制 等方面具有較大的應(yīng)用潛力。 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP）氧化藜蘆醇生成藜蘆醛，藜蘆醛在 310nm 處有特征吸收峰。 通過(guò)測(cè)定 310nm 處的藜蘆醛的增加速率，即可得到木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP）酶活性大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體μL×1 瓶 4℃保存 臨用前用前甩幾下使液體落入底 部，再加 5mL 蒸餾水混勻備用。 試劑二 液體μL×1 支 4℃保存 臨用前用前甩幾下使液體落入底 部，再取出 3.3ul 液體至新的 EP 管 中，再加 2mL 蒸餾水混勻備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板（UV 板）、天平、研缽、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器。 四、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lip）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注意】 若樣本顏色較深（如植物葉片），可引起起始值 A1 值較大如超過(guò) 1.5，可在樣本制備過(guò)程中 增加除色素步驟：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 80%乙醇冰浴勻漿，12000rpm， 4℃離心 10min，棄掉色素較深的上清液；以上除色素步驟重復(fù) 2 次。最后向離心得到的沉淀中加入 1mL 提取液，混勻或再次冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。 ② 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取 液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照數(shù)量（104）：提取液體積(mL)為 500-1000：1 的比例進(jìn)行提取 ③ 液體樣本：若是澄清液體，直接檢測(cè)，若液體樣本渾濁，需 4℃×12000rpm，離心 10min，取上清液檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： 1 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 310nm。 2 所有試劑至常溫狀態(tài)（25℃）。 3 在 96 孔板（UV 板）中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管本試劑盒僅供科研使用 2 提取液 120 樣本上清液 20 試劑一 40 試劑二 20 充分混勻，30℃條件下，10s 時(shí)于 310nm 處讀 取 A1，5min 后再讀取 A2，△A=A2- A1。 【注】：若ΔA 在零附近，可增加取樣質(zhì)量 W（如增至 0.2g 或更多），或增加樣本加樣體積 V1（如 增至 80μL 或更多，則加樣體系中提取液相應(yīng)減少），或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（由 5min 增加至 10min 或更長(zhǎng)），則改變后的 W 和 V1 和 T 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1．按照蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol 藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。 LiP 活性(nmol/min/mg prot)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=430×△A÷Cpr 2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算： 酶活定義：每克樣品每分鐘氧化 1nmol 藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。 LiP 活性(nmol/min/g 鮮重)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=430×△A÷W 3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 酶活定義：每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol 藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。 LiP 活性(nmol/min/104 cell)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(細(xì)胞數(shù)量×V1÷V)÷T=430×△A÷細(xì)胞數(shù)量 4．按照液體體積計(jì)算： 酶活定義：每毫升培養(yǎng)液每分鐘氧化 1nmol 藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。 LiP 活性(nmol/min/mL)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=430×△A ε---藜蘆醛摩爾消光系數(shù)，9300L/mol/cm； d---比色皿光徑，0.5cm； V---加入提取液體積，1mL； V1---反應(yīng)中樣本體積，0.02mL； V2---反應(yīng)總體積，0.2mL=2×10-4； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，5min Cpr---樣本蛋白濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。