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醇?；D(zhuǎn)移酶（AAT）活性測(cè)定試劑盒,微板法

醇?；D(zhuǎn)移酶（AAT）活性測(cè)定試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 醇?；D(zhuǎn)移酶（alcohol O-acetyltransferase, AAT）活性試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS6290W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 醇?；D(zhuǎn)移酶（AAT，EC 2.3.1.84）是酯類化合物生物合成過程中的關(guān)鍵酶，研究表明 該酶活性與果實(shí)中酯類化合物的含量呈正相關(guān)。 醇?；D(zhuǎn)移酶（AAT）催化乙酰 CoA 和醇類化合物生成酯類化合物和 CoA，生成的 CoA具有還原性并可與 DTNB 作用生成黃色物質(zhì)，該有色物質(zhì)在 412nm 處有特征吸收峰， 即可得出 MS 酶活性大小。 反應(yīng)式：acetyl-CoA+a primary alcohol=CoA+an acetyl ester 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 1mL×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部， 再加入 1.1mL 蒸餾水溶解備用， 試劑三 液體 1mL×1 支 4℃保存 試劑四 液體 0.5mL×1 支 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水 四、醇?；D(zhuǎn)移酶（AAT）活性測(cè)定： 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 15min，取上 清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取 液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 15min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 412nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 50 試劑一 100 試劑二 20 試劑三 20 混勻，30℃條件下孵育 10min，立即于 412nm 處讀取吸光值 A1，本試劑盒僅供科研使用 2 試劑四 10 混勻，30℃條件下反應(yīng) 30min，立即于 412nm 處讀取吸光值 A2，ΔA=A2-A1。 【注】：若ΔA 過小，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如：30℃條件下孵育 60min 或更長(zhǎng)），或增加樣本 量 V1（如增至 100μL，則試劑一相應(yīng)減少）。調(diào)整后的 T 或 V1 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.0644x - 0.008，x 是標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量：μg，y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 輔酶 A 定義為一個(gè)酶活力單位。 AAT(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.008)÷0.0644]÷(V1×Cpr)÷T÷Mr×103=13.5×(ΔA+0.008)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 輔酶 A 定義為一個(gè)酶活力單位。 AAT (nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.008)÷0.0644]÷(W×V1÷V)÷T÷Mr×103=13.5×(ΔA+0.008)÷W 4 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 酶活定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 輔酶 A 定義為一個(gè)酶活力單位。 AAT (nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.008)÷0.0644]÷(500×V1÷V)÷T÷Mr×103=0.027×(ΔA+0.008) V1---加入樣本體積，0.05mL； V---加入提取液體積，1mL； T---反應(yīng)時(shí)間，30min； W---樣本質(zhì)量，g； CoA---Mr 分子量，767.5； 500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：用 1mL 蒸餾水溶解標(biāo)準(zhǔn)品（母液需在兩天內(nèi)用且-20℃ 保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.04, 0.08, 0.12,0.16, 0.2 mg/mL。也可根據(jù) 實(shí)際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)以下步驟操作，50μL 標(biāo)準(zhǔn)品+130μL 試劑一+20μL 試劑三，根據(jù)結(jié)果即可制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線。