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多功能氧化酶（MFO）試劑盒

多功能氧化酶（MFO）試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 多功能氧化酶 (MFO)活性測(cè)定說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS5190F 分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 多功能氧化酶 (MFO)是生物體內(nèi)重要的一種解毒酶，可使昆蟲(chóng)適應(yīng)植物的變化；減弱或 免受植物誘導(dǎo)抗性產(chǎn)生的有毒次生物質(zhì)對(duì)昆蟲(chóng)的毒害。 多功能氧化酶（MFO）催化對(duì)硝基苯甲醚產(chǎn)生對(duì)硝基*酚，該產(chǎn)物在 405nm 下有特征吸 收峰，通過(guò)檢測(cè)該物質(zhì)在 405nm 處的光吸收增加速率，進(jìn)而得出 MFO 活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 三、所需的儀器和用品： 可見(jiàn)分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液 器、研缽、冰和蒸餾水。 四、多功能氧化酶 (MFO)活性檢測(cè)： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min， 取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)；若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 405nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 1mL 玻璃比色皿中依次加入： 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 提取液 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×2 支 4℃保存 每支用前甩幾下使試劑落入底部，分 別加入 1.4mL 乙醇，*全溶解后備 用，現(xiàn)配現(xiàn)用。 試劑二 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉體 mg×2 支 -20℃保存 臨用前甩幾下或離心使試劑落到底 部，每支加 2.7mL 蒸餾水溶解，用不 完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反 復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 樣本 250本試劑盒僅供科研使用 2 【注】：若ΔA 小于 0.005，可增加樣本量 V1（如增至 300μL，則試劑二相應(yīng)減少），或增加取樣質(zhì)量 W（如增至 0.2g），則改變后的樣本量 V1 和樣本質(zhì)量 W 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：y = 3.8038x-0.0009， PNP 摩爾濃度（μmoL/mL），y 是△A。 2、按樣本鮮重計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘產(chǎn)生 1nmoL 的對(duì)硝基*酚（PNP）為 1 個(gè)酶活單位。 MFO(nmoL/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0009)÷3.8038×103×V1]÷(W×V1÷V)÷T =8.8×(ΔA+0.0009)÷W 3、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmoL 的對(duì)硝基*酚（PNP）為一個(gè)酶活單位。 MFO(nmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.0009)÷3.8038×103×V1]÷(V1×Cpr)÷T =8.8×(ΔA+0.0009)÷Cpr 4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 酶活定義：每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmoL 的對(duì)硝基*酚（PNP）為一個(gè)酶活單位。 MFO(nmoL/min/104cell)=[(ΔA+0.0009)÷3.8038×103×V1]÷(500×V1÷V)÷T =0.018×(ΔA+0.0009) 5、按液體體積計(jì)算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘產(chǎn)生 1nmoL 的對(duì)硝基*酚（PNP）為一個(gè)酶活單位。 MFO(nmoL/min/mL)=[(ΔA+0.0009)÷3.8038×103×V1]÷V1÷T=8.8×(ΔA+0.0009) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.25mL； T---反應(yīng)時(shí)間，30 min； W---樣本質(zhì)量，g； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的蛋白含量測(cè)定試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10μmoL/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1.4mL 蒸餾水超聲溶解。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0，0.06，0.12，0.18，0.24，0.3 μmoL/mL。 也可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 試劑一 50 試劑二 300 試劑三 100 混勻，立即于 405nm 處讀取吸光值 A1， 37℃孵育 30min 后讀取 A2，ΔA=A2-A1。