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腺苷脫氨酶（ADA)活性測(cè)定試劑盒,微板法

腺苷脫氨酶（ADA)活性測(cè)定試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 腺苷脫氨酶（Adenosine deaminase, ADA)活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū) (貨號(hào)：WS8340W 微板法 96 樣) 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 腺苷脫氨酶（ADA，EC 3.5.4.4）是一種琉基酶，是嘌呤核苷酸代謝的關(guān)鍵酶，與機(jī)體 細(xì)胞的免疫活性有重要關(guān)系。 腺苷脫氨酶（ADA）催化腺嘌呤核苷水解，產(chǎn)生次黃*呤核苷和氨，利用氨在強(qiáng)堿的 環(huán)境下與次氯酸鹽和*酚作用，生成水溶性染料靛酚藍(lán)，溶液顏色穩(wěn)定。其在 630nm 處 有特征吸收峰，通過(guò)檢測(cè)氨增加的速率，即可計(jì)算該酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，每瓶 再加 11mL 蒸餾水溶解備用。 試劑三 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 A：液體 3.5mL×4 瓶 B：液體μL×1 支 4℃保存 臨用前取 30μL 的 B 液進(jìn)一瓶 A 液中， 混勻后作為試劑六使用?；靹蚝蟮脑?劑六一周內(nèi)用完。 標(biāo)準(zhǔn)管 液體 mL×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該標(biāo)曲。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和蒸餾水。 四、腺苷脫氨酶（ADA）活性測(cè)定： 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織（水分足的樣本可取 0.2-0.5g），加入 1mL 提取液；進(jìn)行 冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：也可以按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 ② 液體樣本：直接檢測(cè)；若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 630nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 EP 管依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 40 40 試劑一 100 100 試劑二 100 試劑三 100 混勻，放入 37℃水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱中孵育 30min 試劑三 100 試劑二 100 混勻，室溫 12000rpm 離心 5min，上清液待測(cè)。 ③ 顯色反應(yīng)：在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管本試劑盒僅供科研使用 2 上清液（上步反應(yīng)） 30 30 蒸餾水 30 30 試劑四 60 60 試劑五 30 30 試劑六 60 60 充分混勻，37℃放置 20min 后，于 630nm 處讀取吸光值 A， ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。 【注】1. 試劑四和五和六需分開(kāi)加，不能事先混勻。 2. 若ΔA 的值較小，可增加 37℃孵育時(shí)間（如增至 1 小時(shí)或更長(zhǎng)），或在顯色階段增加上清液量 V1(如增至 60μL，則蒸餾水體積相應(yīng)減少)；則改變后的 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 3. 若 A 測(cè)定大于 1.5，可減少 37℃孵育時(shí)間（如減至 10min 或更短），或在顯色階段減少上清液 量 V1(如減至 15μL，則蒸餾水體積相應(yīng)增加)；則改變后的 T 和 V1 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = 58.121x - 0.0118；x 為標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量（μmoL），y 為吸光值ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克蛋白質(zhì)每小時(shí)催化腺苷生成 1μmoL 氨定義為一個(gè)酶活力單位。 ADA(μmoL/h/mg prot)=(ΔA+0.0118)÷58.121×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T =9.75×(ΔA+0.0118)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每小時(shí)催化腺苷生成 1μmoL 氨定義為一個(gè)酶活力單位。 ADA (μmoL/h/g 鮮重)=(ΔA+0.0118)÷58.121×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T =9.75×(ΔA+0.0118)÷W 4、按照液體體積計(jì)算： 單位定義：每毫升液體每小時(shí)催化腺苷生成 1μmoL 氨定義為一個(gè)酶活力單位。 ADA (μmoL/h/mL)=(ΔA+0.0118)÷58.121×(V2÷V3)÷V1÷T=9.75×(ΔA+0.0118)÷W V---提取液體積，1mL； V1----加入②歩反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL； V2---②歩反應(yīng)體系總體積：0.34mL； V3---③歩顯色步驟中上清液體積，0.03mL； T---反應(yīng)時(shí)間，0.5h； W---樣本質(zhì)量； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 標(biāo)準(zhǔn)品母液（10μg/mL 的氨（分子量是 18）），把母液用蒸餾水稀釋成以下濃度梯度 的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 2, 4, 6, 8, 10 μg/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 2 按照顯色反應(yīng)階段的測(cè)定管加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。