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亞硝酸還原酶(NiR)試劑盒,微板法

亞硝酸還原酶(NiR)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）試劑盒說明書 （貨號：WS8040W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 亞硝酸還原酶（NiR，EC1.7.2.1）是一類能催化亞硝酸鹽還原的氧化還原酶，廣泛存在于微生物及植 物體內(nèi)，是自然界氮循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為 NO 或 NH3，從而減少環(huán)境中亞硝 態(tài)氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對生物體的毒害作用。 亞硝酸還原酶可將 NO2 -還原為 NO，使樣品中參與對–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成（粉）紅色偶氮 化合物的 NO2 -減少，根據(jù)顏色深淺即 540nm 處吸光值的變化可反應(yīng)亞硝酸還原酶的活性。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 用前搖勻，且用蒸餾水稀釋一倍后 做為提取液使用。 試劑一 粉體 mg×4 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，每 支加 3mL 提取液溶解。 試劑二 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再 加 6mL 提取液溶解。 試劑三 試劑三 Amg×3 支 試劑三 Bmg×3 支 4℃保存 臨用前一支試劑 A 和 B 分別用 1mL 蒸餾水wan全溶解，再把 1mL 試劑 B 倒入 1mL 試劑 A 中混成試劑三 mix(一周內(nèi)用完)。 試劑四 粉體 g×1 瓶 4℃保存 臨用前加 12mL 蒸餾水溶解。 試劑五 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 臨用前，可依據(jù)待檢測樣本數(shù)量， 把試劑五和六等比例混合成無色的 反應(yīng) mix（注意觀察，若變粉色， 則不能使用）。 兩天之內(nèi)用完。 試劑六 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液器、天平、研缽、水浴鍋、低溫離心機(jī)。 四、亞硝酸還原酶（NiR）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，熟悉實驗流程，避免實驗樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min， 取上清，置冰上待測。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液； 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，300W，超聲 3s，間隔 7s，總時間 3min）；10000g 4℃離 心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(104個)：提取液體積(mL)為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm。 ② 在 EP 管中加入下列試劑： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管本試劑盒僅供科研使用 2 試劑一 50 50 試劑二 50 提取液 330 430 樣本 20 20 試劑三 mix 50 混勻（此時反應(yīng)液應(yīng)為深藍(lán)色），于 37℃下反應(yīng) 30min 后，立即于漩渦 震蕩儀上劇烈震蕩直到顏色wan全消失。 試劑四 50 50 混勻，12000rpm，室溫離心 5min，上清液待測。 ③ 顯色反應(yīng)，在 96 孔板中依次加入： 上清液 20 20 蒸餾水 100 100 反應(yīng) mix 100 100 混勻，室溫反應(yīng) 10min，立即于 540nm 處分別讀取吸光值 A，△A =A 對照- A 測定（每個測定管需設(shè)一個對照管）。 【注】：1. 若△A 值在零附近徘徊，可增加樣本體積 V1（如增至 50μL 或更多，則提取液相應(yīng)減少），或延 長反應(yīng)時間 T（如增至 1h），則改變后的 V1 或 T 代入計算公式重新計算。 2. △A 值需小于 1，若大于則需減少樣本體積 V1（如減至 10μL 或更少，則提取液相應(yīng)增加），或 縮短反應(yīng)時間 T（如減至 10min），則改變后的 V1 或 T 代入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 1.8966x + 0.0119；x 為標(biāo)準(zhǔn)品摩爾濃度（μmol/mL），y 為△A。 2、按照蛋白含量計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每小時還原 1μmol NO2 ˉ的量為一個酶活力單位。 NiR(μmol/h/mg prot)=[(△A-0.0119)÷1.8966×V2]÷(V1×Cpr)÷T=29×(△A-0.0119)÷Cpr 3、按照樣本質(zhì)量計算： 酶活定義：每三克組織每小時還原 1μmol NO2 ˉ的量為一個酶活力單位。 NiR(μmol/h/g 鮮重)=[(△A-0.0119)÷1.8966×V2]÷(W×V1÷V)÷T=29×(△A-0.0119)÷W 4、按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計算： 酶活定義：每 104個細(xì)胞每小時還原 1μmol NO2 ˉ的量為一個酶活力單位。 NiR（μmol/h/104 cell)=[(△A-0.0119)÷1.8966×V2]÷(細(xì)胞數(shù)量×V1÷V)÷T =29×(△A-0.0119)÷細(xì)胞數(shù)量 V---加入提取液體積，1mL； V1---體系中加入樣本體積，0.02mL； V2--反應(yīng)階段總體積，0.55mL； T---反應(yīng)時間，30min=1/2h； 細(xì)胞數(shù)量---500 萬； W---樣本質(zhì)量，g； Cpr---樣本蛋白含量，建議使用本公司 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 標(biāo)準(zhǔn)品母液（100μmol/mL）：標(biāo)準(zhǔn)品用 1mL 蒸餾水溶解。（需兩天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4,0.5. μmol/mL。本試劑盒僅供科研使用 3 按照顯色反應(yīng)階段的加樣順序操作：根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 3