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α-半乳糖苷酶(α-GAL)試劑盒,微板法

α-半乳糖苷酶(α-GAL)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase, α-GAL）試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS3250W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： α-半乳糖苷酶(α-GAL，EC 3.2.1.22)可特異性地水解多糖、糖脂、糖蛋白中糖鏈末端 的α-半乳糖苷鍵。在人、動(dòng)物、植物、微生物體內(nèi)均存在。在食品飼料和醫(yī)藥等領(lǐng)域中 有著廣泛的應(yīng)用前景。 本試劑盒提供一種簡(jiǎn)單，靈敏，快速的測(cè)定方法，α-GAL 分解對(duì)-硝基苯-α-D-吡喃半 乳糖苷生成黃色的對(duì)-硝基*酚（PNP），后者在 405nm 有吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值 升高速率來(lái)計(jì)算α-GAL 活性。 二、測(cè)試盒組成和配制： 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前加 1.5ml 水。 試劑二 液體 5mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液 20mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、α-半乳糖苷酶（α-GAL）活性檢測(cè)： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱(chēng)取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，冰浴 勻漿，然后 12000rpm，4℃，離心 10min，取上清作為粗體液，置于冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌或細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì) 胞，加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000 rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積（mL)為 500~1000:1 比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，溫度設(shè)定 37℃，波長(zhǎng)設(shè)定為 405nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 10 10 試劑一 25 蒸餾水 25 試劑二 35 35 迅速混勻，37℃保溫 30min 試劑三 180 180本試劑盒僅供科研使用 2 混勻， 取 200μL 轉(zhuǎn)移到 96 孔板中，405nm 處測(cè)定吸光 值 A，ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。 【注】：若ΔA 過(guò)小，可以延長(zhǎng)保溫時(shí)間（如：40min 或更長(zhǎng)），或增加樣本上樣量 V1 （如增至 30μL，則試劑三相應(yīng)減少），則改變后的 T 或 V1 需重新代入計(jì)算公式計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：y = 0.0438x - 0.0008：x 是標(biāo)準(zhǔn)品 PNP 的質(zhì)量（nmol），y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚(PNP)定義為一個(gè)酶活單位。 α-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0008)÷0.0438]÷(V1×Cpr)÷T=76.1×(ΔA+0.0008)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚(PNP)定義為一個(gè)酶活單位。 α-GAL 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0008)÷0.0438]÷(W×V1÷V)÷T=76.1×(ΔA+0.0008)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚定義為一個(gè)酶活性單位。 α-GAL 活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA+0.0008)÷0.0438]÷(500×V1÷V)÷T=0.152×(ΔA+0.0008) 5、按液體體積： 單位定義：每毫升液體每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚(PNP)定義為一個(gè)酶活單位。 α-GAL 活性(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0008) ÷0.0438]÷V1÷T=76.1×(ΔA+0.0008) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，30min； PNP 對(duì)分子質(zhì)量---139.11； 500---細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量，萬(wàn)； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1ml 蒸餾水。 2 把母液用蒸餾水稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3mg/mL。也 可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 在 EP 管加入：10μL 標(biāo)準(zhǔn)品+25μL 蒸餾水+35μL 試劑二+180μL 試劑三，混勻，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 下讀取吸光值。 4 根據(jù)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。