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乙酰βD氨基葡萄糖苷酶(NAG)試劑盒,微板法

乙酰βD氨基葡萄糖苷酶(NAG)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG）試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS2350W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG，EC 3.2.1.52）是溶酶體中的一種酸性水解酶，廣 泛存在于各種組織、體液和細(xì)胞中，該酶活性變化與機(jī)體某些病理狀態(tài)密切相關(guān)。 NAG 分解 4-硝基酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖生成對(duì)-硝基*酚（PNP），在 415nm 處檢測(cè) 該產(chǎn)物的升高速率，來計(jì)算 NAG 活力大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再加 入 4.2mL 蒸餾水，充分溶解備用，用 不完的試劑仍-20℃保存； 試劑二 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 65mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器。 四、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本的制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本取 0.5g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴 勻漿。15000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本，可以按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 提取 ② 細(xì)菌或細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì) 胞，加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000 rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 提取 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 415nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 20 20 試劑一 80 蒸餾水 80 試劑二 100 100 迅速混勻，37℃保溫 30min 試劑三 600 600 混勻， 取 200μL 至 96 孔板中，415nm 處測(cè)定吸光值 A， ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管）。本試劑盒僅供科研使用 2 【注】：1.若ΔA 在零附近徘徊，可延長(zhǎng) 37℃孵育時(shí)間 T（如增至 1 小時(shí)或更長(zhǎng)），或增加加樣體積 V1 （如增至 50μL，則試劑二相應(yīng)減少）或增加取樣質(zhì)量 W（如增至 0.2g）。則改變后的 T 和 V1 和 W 需代入公式重新計(jì)算。 2.若 A 測(cè)定大于 1.5 或△A 大于 1.5，可縮短 37℃孵育時(shí)間 T（如減至 10min 或更短）或減少 加樣體積 V1（如減至 10μL，則試劑二相應(yīng)增加）。則改變后 T 和 V1 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0126x - 0.0183；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（nmol），y 為吸光值ΔA 。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚（PNP）定義為一個(gè)酶活性單位。 NAG 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0183) ÷0.0126]÷(V1×Cpr)÷T=132.3×(ΔA+0.0183) ÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚（PNP）定義為一個(gè)酶活性單位。 NAG 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0183) ÷0.0126]÷(W×V1÷V)÷T=132.3×(ΔA+0.0183)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 單位定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚（PNP）定義一個(gè)酶活單位。 NAG 活性(nmol/min/104cell)=(ΔA+0.0183) ÷0.0126]÷(500×V1÷V)÷T =0.26×(ΔA+0.0183) 5、按液體體積計(jì)算： 單位定義：每毫升樣本每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚（PNP）定義為一個(gè)酶活性單位。 NAG 活性(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0183) ÷0.0126]÷V1÷T=132.3×(ΔA+0.0183) V----加入提取液體積，1mL； V1----加入反應(yīng)體系中樣本體積，20μL=0.02mL； W----樣本質(zhì)量，g； 500----細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬； T----反應(yīng)時(shí)間，30min； PNP 對(duì)分子質(zhì)量----139.11。 Cpr----樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1ml 蒸餾水。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 在 EP 管加入：20μL 標(biāo)準(zhǔn)品+180μL 試劑二+600μL 試劑三，混勻，取 200μL 至 96 孔板中，于 415nm 下讀取吸光值。 4 根據(jù)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。