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內(nèi)切-β1,4-葡聚糖酶/纖維素酶試劑盒微板法

內(nèi)切-β1,4-葡聚糖酶/纖維素酶試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維素酶試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS3350W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶（EC3.2.1.4）存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)物體內(nèi)，是纖維素酶系的組份 之一，這類(lèi)酶隨機(jī)水解β-1,4-糖苷鍵，將無(wú)定形長(zhǎng)鏈纖維素分子截短，將其分解成葡萄糖、 纖維二糖、纖維三糖等各種類(lèi)型的還原糖，在堿性條件下，產(chǎn)生的還原糖能與3,5-二硝基 水楊酸反應(yīng)生成棕紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在540nm下有吸收峰，即可得出內(nèi)切-β-1,4-葡聚 糖酶的酶活性大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 110mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 32mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 瓶 4℃保存 臨用前加 16mL 試劑一，80℃水 浴，攪拌至溶解，仍 4℃保存。 試劑三 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維素酶活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織：稱(chēng)取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷的 95%乙醇冰浴 勻漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經(jīng) 預(yù)冷的 80%乙醇混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。 再向沉淀中加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷提取液，渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測(cè)。 ② 細(xì)菌/培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì) 胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間 隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500：1 比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：若是澄清液體，直接檢測(cè)，若液體樣本渾濁，需 4℃×12000rpm，離心 10min， 取上清液檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 EP 管中依次加入： 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 50 50 試劑一 150 試劑二 150 37℃孵育 60min 試劑三 150 150本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，95℃水浴 5min，取出后用自來(lái)水或冰水冷卻至室溫， 取 200μL 澄清液體于 96 孔板中，在 540nm 處讀取吸光值 A，ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管（每個(gè)樣本做一個(gè)對(duì)照管）。 【注】若ΔA 在零附近如低于 0.005，可增加樣本取樣質(zhì)量 W 或增加樣本加樣體積 V1（如增至 80μL， 則試劑三相應(yīng)減少），則改變后的 W 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為 y = 0.0132x - 0.0545；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 為ΔA。 2、按照蛋白濃度計(jì)算 單位定義：每毫克組織蛋白每小時(shí)催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。 內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維素酶活力(μg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(Cpr×V1) ÷T =1515.2×(ΔA+0.0545) ÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算 單位定義：每克組織每小時(shí)催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。 內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維素酶活力(μg/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(W×V1÷V) ÷T =1515.2×(ΔA+0.0545)÷W 4、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算 單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。 內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維素酶活力(μg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(500×V1÷V) ÷T =3×(ΔA+0.0545) 5、按液體體積計(jì)算 單位定義：每毫升液體每小時(shí)催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。 內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維素酶活力(μg /h/mL)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷V1÷T =1515.2×(ΔA+0.0545) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.05 mL； T---反應(yīng)時(shí)間，60 min=1 小時(shí)； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（2mg/mL）：從標(biāo)準(zhǔn)品管中稱(chēng)量取出 4mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸餾水混勻溶解即 2mg/mL 的葡萄糖（母液需在兩天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2. mg/mL。也可 根據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)對(duì)照管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。