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β-1,3-1,4-葡聚糖酶活測定試劑盒,微板法

β-1,3-1,4-葡聚糖酶活測定試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶（β-1,3-1,4-glucanase）酶活試劑盒說明書 （貨號：WS4750W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： β-1,3-1,4-葡聚糖酶（又稱地衣多糖酶；EC 3.2.1.73）是一類重要的水解酶，可以水解谷物 中的β-1,3-1,4-葡聚糖，其在食品、飼料和紡織等領(lǐng)域的具有重要應(yīng)用價值。 β-1,3-1,4-葡聚糖酶水解底物葡聚糖產(chǎn)生還原性糖。利用 3,5-二硝基水楊酸測定還原糖的 量，在 540nm 讀取吸光值，進(jìn)而得出β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底 部，再加 1.1mL 蒸餾水，80℃ 水浴 10min 充分溶解，冷卻至 室溫待用。 試劑三 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)試移液器、臺式離心機(jī)、水浴鍋、移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、β-1,3-1,4-葡聚糖酶（β-1,3-1,4-GA）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g）到研缽內(nèi)，加入 1mL 提取液，在冰上進(jìn) 行冰浴勻漿或者液氮研磨。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 [注】：也可以按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 ② 細(xì)菌/真菌樣本： 先收集細(xì)菌/真菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)菌/真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超聲波破碎細(xì)菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：也可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：若是澄清液體，直接檢測，若液體樣本渾濁，需 4℃×12000rpm，離心 10min， 取上清液檢測。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 50 50 試劑一 140 150 試劑二 10 混勻，37℃孵育 30min 試劑三 150 150本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，95℃水浴 5min，取出后用自來水或冰水冷卻至室溫， 取 200μL 澄清液體于 96 孔板中，在 540nm 處讀取吸光值 A，ΔA=A 測定管-A 對照管（每個樣本做一個對照管）。 【注】:若ΔA 在零附近徘徊，可在樣本制備時加大取樣質(zhì)量 W（如增至 0.5g）,或在上機(jī)檢測 時加大上樣量 V1（由 50μL 增加到 100μL，則試劑一相應(yīng)減少，保持總體積不變）， 或延長反應(yīng)時間 T（如增至 60min）,則改變后的 W、V1 和 T 需帶入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.0123x - 0.035；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘分解葡聚糖產(chǎn)生 1μg 還原性糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-1,4-GA(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.035)÷0.0123]÷(V1×Cpr) ÷T =54.2×(ΔA+0.035)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織樣本每分鐘分解葡聚糖產(chǎn)生 1μg 還原性糖定義為一個酶活性單位。 β-1,3-1,4-GA(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.035)÷0.0123]÷(W×V1÷V) ÷T =54.2×(ΔA+0.035)÷W 4、按細(xì)菌/真菌數(shù)量計算： 酶活定義：每 1 萬個細(xì)菌或真菌每分鐘分解葡聚糖產(chǎn)生 1μg 還原性糖定義一個酶活性單位。 β-1,3-1,4-GA(μg/min /104 cell)=[(ΔA+0.035)÷0.0123]÷(500×V1÷V) ÷T=0.11×(ΔA+0.035) 5、按液體體積計算： 酶活定義：每毫升液體中每分鐘分解葡聚糖產(chǎn)生 1μg 還原性糖定義一個酶活性單位。 β-1,3-1,4-GA(μg/min/mL)=[(ΔA+0.035)÷0.0123]÷V1÷T=54.2×(ΔA+0.035) V---提取液體積，1mL； V1---樣本上樣體積，50μL =0.05mL； T---反應(yīng)時間，30min； W---樣本鮮重，g； 500---細(xì)菌/真菌總數(shù)，500 萬； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品（1mg/mL）：從標(biāo)準(zhǔn)品管中稱量取出 2mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸餾水混勻溶解即 1mg/mL 的葡萄糖（母液需在兩天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. mg/mL。也可 根據(jù)實際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù) 50μL 標(biāo)準(zhǔn)品+150μL 試劑一+150μL 試劑三，混勻 95℃水浴 5min，取出后用自 來水或冰水冷卻至室溫，取 200μL 澄清液體于 96 孔板中，在 540nm 處讀取吸光值 A，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。