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試劑準(zhǔn)備

1.使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫 （18-25℃），試劑不能直接在 37℃ 溶解。

2.標(biāo)準(zhǔn)品 （凍干品）：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1 mL，蓋好后室溫靜置大約 10 分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為 1000pg/mL。準(zhǔn)備 7 個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的 EP 管，每個(gè) EP 管中加入 500μL 的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成 1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6pg/mL，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 （0pg/mL） 直接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
 

3.檢測溶液 A 及檢測溶液 B：Detection A 及 Detection B 在使用前請手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液 A 或 B1:100 稀釋 （如：10μL 檢測溶液 A/990μL 檢測稀釋液 A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制 （100μL/孔），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制 0.1-0.2 mL。

4.濃洗滌液：用 580 mL 蒸餾水或去離子水將 20 mL 濃洗滌液稀釋至 600 mL，進(jìn)行 30 倍稀釋。

5.底物溶液：請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的 TMB 至另一干凈容器中使用，容器中剩余的底物應(yīng)予丟棄，不要倒回 TMB 瓶中。

注意：

1、 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋不能直接在板中進(jìn)行。

2、 標(biāo)準(zhǔn)品請于臨用前 15 分鐘內(nèi)配制。該標(biāo)準(zhǔn)品只能使用一次。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液 A 工作液、檢測溶液 B 工作液請使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆?；靹驎r(shí)要輕輕充分混勻，避免起泡。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確請使用微量吸管，并校準(zhǔn)微量加液器。請依據(jù)所需的量配制，盡量不要微量配制 （如吸取檢測溶液 A 時(shí)，一次不要小于 10μL），以避免造成濃度誤差。

4、 請勿重復(fù)使用已經(jīng)稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液 A 工作液和檢測溶液 B 工作液。

5、 濃洗滌液中如有結(jié)晶析出，請先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結(jié)晶*溶解再進(jìn)行配制。

6、 試劑盒中部分試劑為儲存液，客戶需配置成工作液后使用，在配置過程中如因純凈水質(zhì)量差或水質(zhì)污染，以及實(shí)驗(yàn)中所用耗材潔凈度差，可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)

操作步驟

1.加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔 7 孔，依次加入 100μL 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 （見試劑準(zhǔn)備 2）?？瞻卓准?100μL（見試劑準(zhǔn)備第二步*后一管），余孔加待測樣品 100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃ 溫育 2 小時(shí)。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。

3.每孔加檢測溶液 A 工作液 100μL（臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37℃ 溫育 1 小時(shí)。

4.棄去孔內(nèi)液體，每孔用 300μL 的洗滌液洗滌，浸泡 1-2 分鐘，吸去 （不可觸及板壁） 或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次 （也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干），重復(fù)洗板 3 次。*后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液*甩干。自動(dòng)洗板機(jī)亦可。

5.每孔加檢測溶液 B 工作液 （臨用前配制）100μL，加上覆膜，37℃ 溫育 1 小時(shí)。

6.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 4。

7.每孔加底物溶液 90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃ 避光顯色 （反應(yīng)時(shí)間控制在 15-25 分鐘，不要超過 30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前 3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后 3-4 孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）。

8.每孔加終止溶液 50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。

9.在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長測量各孔的光密度 （O.D. 值）。

注意：

1.試劑準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。

2.加樣：實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時(shí)注意不要有氣泡，將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。加樣或加試劑時(shí)，個(gè)孔與*后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的「預(yù)溫育」時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。因此，一次加樣時(shí)間 （包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品） 控制在 10 分鐘內(nèi)。設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)請將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

4.洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響*后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí) 驗(yàn)過程中。

5.反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化 （比如，每隔 10 分鐘觀察一次），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

6.底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

7.如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)濕度低于 60%，使用加濕器提高濕度水平。