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上海邦景實(shí)業(yè)有限公司
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PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)優(yōu)化
2024-5-6 閱讀(55)
實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
PCR反應(yīng)條件的控制：
1. PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2. 鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
5. 引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。
6. 反應(yīng)溫度
（1）變性溫度和時(shí)間95℃，30 s。
（2）退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7. 循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期"。
PCR的循環(huán)參數(shù)：
1. 預(yù)變性（Initial denaturation）
模板DNA全變性與PCR酶的全激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。
2. 循環(huán)中的變性步驟
循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間，變性時(shí)間過長(zhǎng)損害酶活性，過短靶序列變性不徹di，易造成擴(kuò)增失敗。
3. 引物退火（Primer annealing）
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。
退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略
延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。
5. 循環(huán)數(shù)
大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。
6. 最后延伸
在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。
